• Forum - Sites, Restrictions, Clonage

[Biologie Moléculaire] Problème de culture de bactéries

- D'autre part, je viens de voir que c'est un vecteur qui est linéaire. Avec quel polymérase amplifie tu ton insert Tu peux essayer, pour augmenter le rendement de ton clonage, de faire un petit traitement à la Taq en plus, pour qu'elle rajoute des A à la fin de tes inserts s'il n'y en a pas, le protocole est dans le manuel du Kit pGEmT.  [...] Essaie un autre vecteur pour le clonage peut-être, avec le vecteur TOPO plutôt que pGEmt-easy. Ou bien en amplifiant avec des amorces ayant des sites de restrictions puis clonage dans un vecteur adapté à ce que tu veux faire de tes inserts.  [...]

[Biochimie] Gfp

Est ce que quelqu'un pourrait m'expliquer comment on utilise la GFP pour marquer une proteine que l'on veut localiser Peut on marquer la proteine directement ou est on obligé de faire une fusion entre le cDNA et la GFP.   [...] Il existe plusieurs plasmides qui contiennent déjà la séquence codante pour la GFP en phase avec des sites de restrictions permettant de cloner le cDNA. En gros, ça ne change rien par rapport au clonage dans un vecteur d'expression basique en terme de manip'.  [...]

[Biologie Moléculaire] Détection d'une protéine

Sinon pas le choix, faut refaire le clonage. S' il y a encore des sites de restrictions uniques en 3', il est possible d'y cloner une séquence composée de 2 longs oligos hybridés codant pour une étiquette, mais ca ne me semble pas beaucoup plus simple que de recommencer malheureusement.  [...] Pour ma part, je me demande si je n'ai pas que des mauvais oligos parce que j'ai refait 5 fois mon clonage (digestion plasmide, insert, PCR...) et quand je séquence je retrouve tout le temps le même problème. il me manque au moins 20 nucléotides et y en a 4 qui sont apparus (TTGG je crois).  [...]

[Biologie Moléculaire] Numérotation des sites de restriction

Bonjour à tous j'aimerais savoir comment on numéroté les sites de restriction sur un plasmide. Je dois numéroter les sites de restriction de l'insert d'un plasmide recombinant et je ne sais pas comment faire. Merci d'avance pour la réponse.  [...] On parle d'insertion directionnelle dans un vecteur quand l'on maîtrise le sens de son insertion dans le vecteur, par exemple parce que l'on a choisit de procéder par clonage avec 2 sites de restrictions incompatibles ( chaque extrémité de l'insert se ligera à la seule extrémité compatible du vecteur).  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

pour le protocole de clonage, la première étape est la création d'une banque d'adn (extraction adn, digestion par une enzyme de restriction puis ligation de ces fragments dans des plasmides portant les sites de restrictions de l'enzyme restriction choisie).  [...] 1. identifier votre fragment (si l'organisme a déjà été séquencé, voir la carte de restriction et repérer les sites de restrictions absents du fragment).  [...]

[Biologie Moléculaire] D'une protéine à un gène à une protéine

On met ensuite une ligase qui va joindre les différents fragments entre eux. on a alors une séquence double brin d'ADN qui contient l'information génétique de la protéine voulue. Ensuite il faut insérer cette séquence dans un vecteur d'expression. Donc on aura pensé à ajouter des sites de restriction de part et d'autre du gène synthétique pour pouvoir l'insérer dans un vecteur.  [...] Et ils optimisent les codons pour l'expression dans l'hôte choisi, ils optimisent les séquences pour la stabilité des mRNA, et on peut leur imposer des sites de restrictions dans le gène (pratique pour faire des cassettes)... Si on leur donne le plasmide d'expression, ils font même le clonage (mais il y a un surcoût de quelques centaines d'euros).  [...]

[Biochimie] clonage

Non pas nécessairement. Si les deux sites de restrictions sont dans la cassette de clonage (ce qui doit être le cas), alors on retire entre 10 et 50 pb que l'on ne verra pas sur gel. Le plasmide semblera simplement linéarisé.  [...] D'où proviennent les sites de restrictions de vos inserts Sont-ils sur les oligos Si oui, avez-vous contrôlé qu'ils soient corrects Toujours dans la même optique, si les oligos sont corrects en théorie, ont-ils été purifiés HPLC Il peut toujours y avoir eu une erreur à la synthèse.  [...]

[bio mol] pUC et LacZ

le plasmide pUC possède une zone portant un nombre important d'initiateur au clonage. Si j'ai compris lorsque qu'il y a qu'un seul site de restriction, l'insertion de l'insert ne se fait pas forcement à l'endroit souhaité c'est à dire au plus près de ce site.  [...] S'il n'y avait qu'un seul site de clonage, tu aurais une grosse contrainte sur ton ADN de départ et donc presque jamais la possibilité de le découper pour en isoler ton fragment d'intérêt (ou alors, tu aurais à l'amplifier avec de amorces portant le site de restrictions, ce qui est plus lent et peut génerer des erreurs).  [...]

[Biologie Moléculaire] Ajout de sites de restrictions

Ce qu'il faut faire c'est simplement prendre votre ORF et l'amplifier par PCR en ajoutant aux amorces les sites de restrictions+ 6 nucléotides aléatoires.  [...] En faisant comme cela, vous allez récupérer votre ORF borné par les sites de restriction. Vous n'aurez plus qu'à digérer et cloner directement dans votre plasmide d'intérêt.  [...]

Clonage orienté

Je suis bloquée, j'ai un peu de mal avec les enzymes de restrictions et je comprend pas tout à fait ce que l'on me demande. Sachant que l'on veut un clonage orienté, on me demande de choisir les enzymes de restrictions utilisable du côté de la bordure portant la séquence du promoteur T7 sachant que le fragment d'intérêt contient un site SacII.  [...] Si c'est bien le cas, cela signifie que tu ne peux pas utiliser SacII pour le clonage. En effet, le clonage va consister à amplifier ton insert avec des oligos de PCR portant des sites de digestion aux enzyme de restriction voulues. On ne veut donc pas que la digestion en question coupe ton insert en deux.  [...]