• Forum - Restriction, Plasmide, Séquence, Sens

génie génétique

Bonjour, Puis-je m'adresser directement à vous sur quelques points de biologie moléculaire (enzymes de restriction, électrophorèse, test de paternité, PCR etc. ) Je ne peux malheuresement pas le faire car il semblerait que votre boite mail soit pleine, pouvez-vous me communiquer une adresse où je pourrais faire suivre mes messages merci d'avance.  [...] Pour répondre mainteant à la question (ouf), tu peux réaliser une cartographie de restriction puis sortir ta petite calculette pour vérifier si ton plasmide à intégrer ta séquence en sens ou antisens.  [...]

PCR problème de poids moléculaire

Alors voilà j'ai reçu un plasmide d'un collaborateur contenant une séquence qui m'intéresse. Je dois récupérer cette séquence pour la sous-cloner dans un autre vecteur. J'ai donc designé 2 primers contenant le début ou la fin de ma séquence + un site de restriction enzymatique.  [...] alors ce ne sont pas des problèmes de migration ou d'agarose j'ai vérifié... J'ai pensé à la complémentarité mais quand je séquence le plasmide de départ avec les primers utilisés pour ma PCR je retrouve la séquence attendue, ce qui veut dire qu'ils s'hybrident au bon endroit.  [...]

[Biotechnologie] Le clonage

Je suis devant un exercice où je dois donner les différentes étapes me permettant de construire un plasmide recombiné. Celui-ci ayant deux site de restriction CpoI. Je dois y inserer un gène, mais dans la séquence de part et d'autre du gène je n'ai pas de site de restriction.  [...] J'ai en plus sur ce plasmide, un gène de résistance à la Kanamycine, comment se fera son expression (je pense par des ARN polymérases provenant du génome bactérien).  [...]

[Biologie Cellulaire] Enzyme de restriction

Le plasmide X2R contient dans sa séquence 2 sites de restriction BamH2 et 2 sites de restriction Sif1. J'obtiens deux fragments d'ADN après traitement du plasmide par BamH2. Cela signifie que.  [...] Nous n'avions pas de schéma du plasmide ni avoir à le connaître, on ne l'avait même pas pris en exemple dans le cours donc je me suis également demandé le rapport avec la séquence ORI.  [...]

[Biologie Moléculaire] hydrolyse du plasmide avec des enzymes de restrictions EcoR1 et Hind3

bonjours a tous je voudrais de laide a propos d'un TP qu'on a fait en biomol en fait on a pris un eppendorf avec dedans plasmide purifié+EcoR1+tampon+eau et on a incuber a 37°C ce que je voudrai savoir c'est linteret de cette incubation.  [...] EcoRI est une enzyme de restriction =. ça va couper ton plasmide en faisant de sticky ends et tu vas pouvoir mettre quelque chose dedans à condition que cette séquence ait les mêmes sticky ends.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation

Ca fait deux semaines que je tente de faire une ligation entre pCLNCX et mon insert. J'ai coupé mon plasmide par HindIII et amplifié mon insert avec des amorces contenant le même site de restriction HindIII, la taille de mon insert est bonne. celle de mon plasmide aussi, il a bien été digéré car j'ai comparé le plasmide digéré ou non.  [...] est- ce - que tu as procédé à une déphosphorylation de l'extrémité 5' de ton plasmide digérée l'utilisation d'une phosphatase alcaline est necéssaire dans l'étape qui précède la ligation puisque tu utilises un seul enzyme de restriction... car au moment de ligation il va être plus facile à un plasmide de se recirculariser plutôt qu'intégrer une autre séquence.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problèmes: Recombinaison d'un plasmide

Lorsqu'on incorpore un gène dans un plasmide disponible dans le commerce, on aimerait insérer le moins d'ADN supplémentaire possible en plus du gène réel avec son promoteur. Parfois, cependant, il n'y a pas de séquence de restriction appropriée dans la région avant et après le gène qui peut également être trouvé dans le plasmide.  [...] Décrire une variante de la PCR, avec laquelle on peut ajouter une telle séquence de restriction avant et après le gène à insérer à n'importe quelle position.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

J'ai transformé des bactéries DH5alpha avec mon plasmide GST et mon plasmide GST-prot d'intérêt. Pour chaque transformation j'ai effectué un contrôle non induit. J'ai testé deux stragégies d'induction avec 1 mM IPTG. 2h à 37°C ou toute la nuit à 30°C.  [...] Y-a-t-il un moyen que je transfecte ca dans des cellules eucaryotyes Je pense que je connais la reponse mais je tente... Ou bien il me faudra sous-cloner ma sequence dans un autre plasmide genre pcDNA3 classique par exemple, n'est-ce pas (si j'arrive a connaitre les enzymes de restriction pour ce faire...).  [...]

[Biologie Moléculaire] Programme de clonage

- Deuxièmement, lui demande de construire ton plasmide. Tu lui donnes ta PCR avec les deux sites de restriction, et de l'autre ton plasmide cible avec tes deux sites. Et tu récupère la séquence totale de ton nouveau plasmide. Je ne m'embette plus à faire ça sur papier et à vérifier 20 fois si j'ai fais une erreur de phase ou autre en tapant mes séquences vu que tout est déja sur le mac.  [...] - le gros problème ce sont les insertions. Quand on veut placer une séquence dans une séquence d'un plasmide, souvent on perd des features n ou alors apparaît des features prime. ex à attR1 s'ajoute attR1' et tout est décalé. Souvent je fais mes modif dans Ape et revient sur SC après.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

Voilà, j'ai un plasmide de 10Kb dans lequel je souhaite insérer 3 nucléotides à un endroit bien particulier pour créer un site de restriction. Une fois ce site de restriction présent j'insèrerai mon tag Flag. L'un des points limitant c'est que je souhaite insérer flag dans une boucle extracellulaire courte de ma protéine finale.  [...] 3) Si mes primers les plus extrèmes contenant les sites de restriction uniques du plasmide ont leur séquence commençant directement par ces sites de restriction uniques, y a t-il trop de risques qu'ils soient modifiés (et donc que je perde mes sites de restriction) par une enzyme qui perdrait de sa fidélité justement là où je veux pas.  [...]