• Forum - Rapport, Quantité, Plasmide

[Génétique] Analyse plasmides recombinants/non recombinants

Concernant ta question du puit 6, je serait presque pret à parier que ce que tu vois est ton plasmide B (donc ta matrice) mise en trop grande quantité. Ca ressemble à du plasmide et comme ni ta pcr dans le puit 5 (tu as parlé d'une erreur de manipulation) ni dans le puit 7 (pourquoi) n'ont fonctionné, je serait tenté de dire qu'aucune de tes PCR n'a marché malheureusement.  [...] Le probleme c'est que pour le puits 6 je ne sais pas quoi déduire... Pourquoi y a t il 2 bandes La bande a 3000 correspondrait à un excès de plasmides non recombinants et la bande a 6000 mon plasmide contenant l'insert Le soucis c'est que quand j'ai lysé les bactéries, je n'en n'ai vu aucune de bleue dans le culot contrairement à l'échantillon A.  [...]

[Biologie Cellulaire] Toujours problème de vecteurs...

Ben comme je disais dans ton autre sujet stabilité de l'ARNm, on utilise les plasmides non réplicatifs (sans origine de réplication, on appelle ça des plasmides suicide) surtout pour des études de régions régulatrices sur de courtes périodes.  [...] Par contre pour produire une protéine en quantité suffisante comme dans ton cas, il faut une ori à ton plasmide.  [...]

Precipitation adn plasmidique

Bonjour, après une extraction d'adn plasmidique avec un kit qiagen, je me retrouve avec de faibles concentrations de plasmide. Je souhaterais donc le concentrer un peu afin de pouvoir par la suite le sequencer.  [...] Autre solution tu rajoute a ta culture sur la nuit un peu de chloramphenicol pendant quelques heures. Ca bloque la multiplication des bacteries mais n'affecte pas pas la replication de l'ADN. donc tu augmente la quantité de plasmide dans tes bacteries.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR quantitative

Une solution Utiliser ton échantillon pour faire une gamme standard pour vérifier l'efficacité d'amplification, mais dans ce cas tu n'auras bien évidement pas de quantification absolue, tu ne pourras faire que du relatif par rapport à un gène de ménage, sans compter l'augmentation des coûts due au fait que théoriquement il faudrait faire une gamme pour chaque échantillon.  [...] La Q PCR c'est établir une gamme étalon d'un ADN controle ( Quantité d'ADN au départ connu) généralement un plasmide avec 1000, 10 000 100 000 et enfin 1 000 000 copies et définir pour chaque quantitées le nombre de cycle néssaires pour avoir un signal différent du bruit de fond (le cT) celui-ci est donc inversement proportionnelle à la quantitée d'ADN du départ.  [...]

Plasmide et gène LacZ

La première étape de l'utilisation des plasmides est la détermination des bactéries transformant (qui ont intégré un plasmide non recombinant) et des bactéries transformant recombinant (qui ont intégré des plasmides recombinant, i.e. contenant le gène luc), par rapport aux bactéries non transformant.  [...] Je pense qu'il y a une erreur parce que les bactéries non transformantes ont déjà été éliminées par l'action de l'antibiotique (Amp). Le système LacZ permet de différencier les bactéries (ou colonies) qui ont un plasmide avec l'insert (bactéries transformantes recombinantes) et celle qui ont le plasmide sans l'insert (bactéries transformantes non recombinantes) de part la couleur des colonies observées sur boîte de Pétri (si le milieu est préparé avec de l'IPTG et du XGal).  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Si vous avez 10 000 colonies sur la boite expérimentales et 10 colonies sur la boite contrôle c'est bon. Vous piquez quelques colonies et vous savez que la majorité de vos clones contiendront l'insert. Si vous avec 10 000 et 8 000, vous savez que vos restrictions de plasmides ne sont pas efficaces et qu'il va vous falloir screener pas mal de colonies pour trouver vos petits. Prévoir un colony lift dans ces cas là.  [...] Par contre, je suis d'accord avec le fait que mettre l'insert n'est pas absolument nécessaire. Un contrôle plasmide digéré + ligase en ayant fait un gel rapide pour vérifier que la digestion est totale est suffisant pour vérifier l'activité ligase. Dans ce cadre, la déphosphorylation ajoute une inconnue énorme puisqu'avec ce contrôle on ne peut pas faire le différentiel entre un plasmide mal déphosphorylé, un plasmide trop déphosphorylé où les extrémités ont commencé à être dégradées par CIP et qui n'est pas ligable, et une activité ligase faible.  [...]

[Biologie Moléculaire] compatibilité OriS et Ori de PMB1 dans un même plasmide?

Je vois qu'on est tous du meme avis. pour avoir fait des clonage pUC vs pBC je n'ai jamais vu de plasmide ayant recupéré les deux ori.  [...] J'ai obtenu des colonies de bactéries qui ont poussé avec ce plasmide. Ensuite j'ai prcoédé à des recombinaisons chez la levure et j'ai électroporé les YACs extraits de la levure dans des E. coli DH10bêta. Et là j'ai des résultats bizarres, je ne sais pas si je n'ai pas perdu l'insert, car j'avais des colonies positives (criblage pcr) et après une maxi prep, j'ai obtenu de bonnes quantités d'ADN mais plus de réponse par PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] electrophorèse en gel d'agarose

Mais moi, ce que je ne pige pas dans ta question, c'est combien de cellules je manipule pour avoir la quantité suffisante de plasmides avec lesquels faire joujou Je manipule une cellule.  [...] Mais comme ces choses exceptionnelles ne se produisent, on peut estimer qu'on a affaire à plusieurs plasmides, car on manipule plusieurs cellules, donc on aura affaire à une quantité de topologies différente de 1... D'où le nombre de bandes différent de 1 dans le puits 1 (pBR non digéré).  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Normalement oui tu mettre des plasmides dans des cellules eucaryotes puisque quand j'étais en stage on avait transplanté des plasmide à l'intérieur de cellules cancéreuse. Il s'uffit de faire une électroporation ou autre manipulation du genre pour qu'il soit intégré.  [...] Dans ta dernière question, je suppose que tu suggère d'intégrer un plasmide dans une cellule eucaryote et de le garder en tant que tel, c'est à dire qu'il ne s'intègre pas au génome. Je pense que c'est possible de façon spontanée chez S. Cerevisiae. Pour des cellules de mammifères, cela nécessite qu'elles soient au préalable transformées avec l'antigène T de SV40, comme c'est le cas pour les cellules Cos-7.  [...]

[Biologie Cellulaire] A quoi sert le co-transfert avec un vecteur de résistance à un antibiotique

En fait, on fait une co-transfection car ton plasmide ou se situe ton cDNA ne contient surement pas de gène de résistance. Dans ce cas là, si tu veux sélectionner par la suite uniquement les cellules qui ont intégré le plasmide, il te faut pouvoir les sélectionner.  [...] La meilleure méthode est quand même d'avoir un gène de résistance dans le plasmide où tu as ton gène d'intérêt, ça te permet de minimiser le nombre de clones faux-positifs (uniquement résistant et sans gène d'intérêt).  [...]