• Forum - Quantité, Plasmide, Bactéries

Precipitation adn plasmidique

Bonjour, après une extraction d'adn plasmidique avec un kit qiagen, je me retrouve avec de faibles concentrations de plasmide. Je souhaterais donc le concentrer un peu afin de pouvoir par la suite le sequencer.  [...] Autre solution tu rajoute a ta culture sur la nuit un peu de chloramphenicol pendant quelques heures. Ca bloque la multiplication des bacteries mais n'affecte pas pas la replication de l'ADN. donc tu augmente la quantité de plasmide dans tes bacteries.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Il est possible d'obtenir de grande quantité de protéine en le faisait produire par des bactéries ayant reçu le plasmide recombinant contenant le gène cible.  [...] Se pose aussi le problème des modifications post traductionnelles, et dans ce cas on essai dans des levures humanisées par exemples (après tout dépend de ce que tu veux faire avec ta protéine. etudes structurales, fonctionnelles ou production pharma). Et en effet pour l'expression en bactéries on utilise un plasmide qui reste sous cette forme, il ne s'intègre pas dans le génome.  [...]

[Microbiologie] bacterie resistantes

- Au cours des divisions cellulaires, le plasmide peut ne pas être transmis à certaines bactéries filles, il y aura donc apparition de bactéries non résistantes.  [...] - Lorsqu'on insère un plasmide dans des bactéries, certaines bactéries du lot n'insèrent pas le plasmide et restent donc non résistantes.  [...]

[Microbiologie] Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

Pensez bien à faire pousser un peu de bactéries vides pour vous refaire un stock de compétantes (au CaCl 2 ). Quite à dépenser un peu d'argent, autant ne pas avoir à le faire deux fois, même dans 10 ans.  [...] La compétance est à tester sur boite en transformant les bactéries avec une quantité donnée d'un plasmide temoin. En général, par cette méthode on a un résultat qui va de 10 5 à 5.10 6. ce qui est largement suffisant pour vos besoins.  [...]

Problème de rendement kit Maxiprep

Mais commence déjà par essayer de laisser tes bactéries se développer plus longtemps, plus de bactéries = plus de plasmide (pas trop longtemps non plus car si tu sature tu auras des problème de rendement aussi, mais attend que ta culture liquide soit quand même bien trouble et nuageuse).  [...] Comment la séquence de mon insert peut-elle jouer sur la quantité de plasmide pr ésente dans mes bactéries (j'ai conscience que plus l'insert est gros, plus la réplication est lente, mais encore D'autres paramètres influencent-ils la réplication ).  [...]

[Biochimie] Calcul d'une concentration en ADN

Je suis peut être en train de bloquer sur quelque chose de simple mais je ne vois pas du tout comment faire, et pourtant j'y ai réfléchi. On sait également que le plasmide est de 3500pb, mais je ne vois pas en quoi cela nous aide. 3500pb peut-il correspondre à la quantité d'ADN en moles.  [...] J'ai compris comment déterminer la masse d'ADN présent dans la solution, à partir de la masse d'unités osidique. J'ai également compris comment déterminer la quantité de matière de plasmide à partir de la taille de celui-ci et je vous en remercie d'ailleurs car c'était pas gagné.  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Oui, juste compléter. par la néomycine + strepto, tu sélectionneras les bactéries ayant un plasmide recombiné (on nous demande toujours de faire cette vérification pour être sûr que le plasmide porte bien le gène d'intérêt). Plus intéresant serait de faire une construction avec LacZ à la place du gène de la béta-Lactamase.  [...] Oui, juste compléter. par la néomycine + strepto, tu sélectionneras les bactéries ayant un plasmide recombiné (on nous demande toujours de faire cette vérification pour être sûr que le plasmide porte bien le gène d'intérêt).  [...]

ADN recombinant et plasmide

Bonjour, oui c'est bien cette diapo. J'en ai déduis que le plasmide ne provient pas de cette bactérie car elle a déjà ses chromosomes, normalement si ce serait le plasmide de la même espèce de bactérie alors elle n'aurait pas de chromosomes mais des plasmides, non X et Y sont des bacteries d'espèces différentes.  [...] Lorsqu'on fait une expérience de clonage comme celle que tu vois sur la diapo, le plasmide n'est pas retiré d'une bactérie. C'est un vecteur que l'on a en stock dans nos labos (et que l'on achète à des sociétés qui les produisent souvent) et qui permet d'insérer le fragment d'ADN qui nous intéresse pour le multiplier en grande quantité dans des bactéries (généralement des Escherichia coli ).  [...]

[Biologie Moléculaire] pb de mutagenèse dirigée

je travaille avec un plasmide type pcDNA3 de 4.5 Kb dans lequel g mis l'ADNc du gène du facteur Willebrand (8.9 Kb). l'amorce que j'utilise fait 30 b avec 15 bases de chaque coté de la mutation et elle a été commandée sur le site recommandé par Stratagene, donc je pense pas qu'il y ait un problème à ce niveau.  [...] mon problème est que je n'obtient pas de colonies avec mon plasmide recombiné, les témoins de mutagenèse et de transformation sont OK, j'ai bien des colonies bleues et blanches. mais les bactéries traitées avec mon plasmide ne poussent pas sur le milieu de culture LB+ampicilline quelque soit la quantité d'ADN ou de solution bactérienne étallée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression d'un gène d'enzyme !

un viel homme a isolé une petite quantité d'attractase,une enzyme produisant une phéromone humaine puissante,à partir d'echantillon de cheveux de célébrités hollywoodiennes.Pour produire de l'attractase à son usage personnel,il a obtenu un clone génomique complet du gène de l'attractase,l'a connecté à un promoteur bactérien puissant dans un plasmide d'expression et a introduit le plasmide dans des cellules d'E coli.  [...] il a été anéanti de découvrir qu'aucune attractase n'etait produite par les cellules.Quelle est 'explication de son echec.   [...]