• Forum - Quantité, Enzyme, ADN

[Biologie Moléculaire] Problème de PCR

Pour la faible quantité. pas assez d'enzyme ou enzyme pas efficace, pas assez d'amorce, pas assez d'ADN, contamination des échantillons, machine à PCR dérègler.  [...] Pour la faible quantité, cela peut aussi être dû à une stringence trop élevée, par exemple si la concentration en sels n'est pas assez importante.  [...]

[Microbiologie] tompon de la PCR

C'est la quantité d'enzyme qui incorpore 10 nanomoles de dNTP dans un ADN en 30 minutes a 70°C.  [...] Le forum est un lieu d'échanges donc évitez de demander les coordonnées personnelles de vos interlocuteurs. Soyez plus explicite lorsque vous posez vos questions sinon il nous est impossible de vous répondre clairement.   [...]

[Biologie Moléculaire] Amplification infructueuse

Mais comme je disais ils restent assez vague sur les quantité, (1-20 microlitre d'ADN sans indication sur la concentration optimal pour le fonctionnement de l'enzyme, pareil pour l'enzyme, 0.2-0.5...), et le fait est que dans les articles que j'ai pu lire, ils disent.  [...] après pour les quantité d'ADN il me semble que ca depend un peu de la pol utilisé, par exemple avec phusion pol ca sature plus vite et il faut mettre un peu moins si je me souviens bien, pour ca que je trouve domage qu'ils ne précisent pas dans leur protocole la quantité optimale, mais sinon ducoup je suis sur du 80 ng dans 25 microlitre de V réactionnel en ce moment.  [...]

[Biologie Moléculaire] Fréquence de sites de restriction

Tout dépend des conditions de ta digestion, notamment de la quantité d'ADN génomique que tu fais digérer pour une certaine quantité d'enzyme.  [...] En général, 1 U d'enzyme est définie comme étant la quantité suffisante pour digérer 1microgramme d'ADN d'un génome connu (le plus souvent, l'ADN du phage lambda).  [...]

Polymerase Chain Reaction

L'objectif d'une PCR est d'augmenter la quantité d'ADN pour la rendre plus facilement détectable expérimentalement. Pour ce qui est de la méthode. les brins d'ADN sont chauffé a 95°C, a cette température ils se dénaturent, on se retrouve donc avec deux brins monocaténaires.  [...] Ensuite a 60°C on hybride des amorces sur nos deux brins et a 72°C on introduit une enzyme -la taq polymerase- qui a partir des amorces va synthétiser les brins complémentaires. On se retrouve donc avec deux ADN bicaténaire donc 4 brins au total, on a doublé notre quantité d'ADN et on est prêt pour un nouveau cycle. Souvent on fait une petite trentaine de cycle.  [...]

[Biologie Cellulaire] Chocs trophiques en culture cellulaire

On peut donc aussi utiliser le double ou le simple choc thymidine. On apporte une grosse quantité de thymidine à la cellule ce qui va permettre de saturer une enzyme nescessaire à la synthèse de l'ADN, et donc de bloquer cette synthèse.  [...] Il existe encore d'autres méthodes comme celle utilisant l'hydroxyuréee pour bloquer là encore en G1/S, ou un blocage mitotique au nocodazole.   [...]

[Biologie Moléculaire] Courbes PCR en temps réel

Alors petit rappel. le principe de la PCR quantitative est qu'on est capable de suivre l'évolution de la quantité d'amplicon formée au fil des cycles. Pour cela, on a une matrice, une paire d'amorces ciblant la région que l'on veut amplifier, une enzyme, des nucléotides, et un colorant fluorescent de l'ADN.  [...] Cette PCR est dite quantitative, puisque vu qu'on est capables de savoir a tout moment combien on a synthétisé d'ADN dans le tube, on peut déterminer la quantité initiale de matrice. Cette quantité initiale est déterminée a partir du nombre de cycle nécessaire a ce que l'intensité de fluorescence atteigne un certain seuil.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

Une question. quelle quantité d'ADN plasmidique devrais-je mettre Mon plasmide a une concentration de 150 ng/ul, j'ai fait mon calcul pour le nombre d'unités d'enzyme pour 1 ug d'ADN plasmidique. Est-ce une quantité cohérente (mon clonage ultérieur sera un peu ch****).  [...] Le top pour la digestion (selon protocole promega/ NE Biolabs, teste et approuve par tout le labo) C'est 50 uL volume final (ADN purifie, pas tout juste sorti de PCR), et max 2 uL d'enzyme. Un volume plus petit ca coupe mal, et plus d'enzyme au mieux ca change rien, au pire ca coupe mal ou avec activite star.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

Rapport vecteur.insert 1.10 ok mais tu utilises quelle quantité exactement d'ADN Et tu transformes avec quelle volume de ta ligation (pour quel volume de bactéries ).  [...] la digestion je la fais géneralement avec 1,5 µl d'enzyme 1Hà 37°C. mais comme le signal obtenu après dépos sur gel est trop faible, j'ai augmenté la quantité d'ADN digeré (80µL dans 350 final) avec 5µl d'enzyme de digestion 1h 37°C(j'ai essayé d'amplifier le fragment par pcr, ça ne marche pas).  [...]

Phénomène de réplication (eucaryotes)

-ensuite, une deuxième enzyme, la Polymérase alpha, va synthétiser à la suite de cette amorce, une molécule d'ADN d'environ 30 nucléotides.  [...] -cependant, la Polymérase alpha n'est pas une enzyme très efficace (on dit qu'elle a une processivité faible, c'est-à-dire que pour une quantité de substrat donné, elle incorpore peu de nucléotides). C'est donc la Polymérase delta qui va prendre le relais, car elle possède une processivité élevée, et va s'occuper de synthétiser le reste de la molécule d'ADN.  [...]