• Forum - Quantité, ADN, Finale

[Biologie Cellulaire] Cotransfection de cellules eucaryotes

Je reste toujours à 5 µg d'ADN par diamètre 100. J'ai déjà réaliser des tri-transfections et ça marchait bien. Après faut optimiser la quantité de chaque plasmide. Donc au début essaies 6 µg/6 µg mais si tu vois qu'un des deux s'expriment moins bien, alors tu ajustes du genre 5 µg/7 µg.  [...] L'important c'est que la quantité d'ADN finale reste la même, 12 µg dans ton cas.  [...]

[Biochimie] Petite question sur la PCR

ET d'ailleur la formule qui nous donne la quantité théorique final 2^n - 2n, est fausse, car si on a l'allèle paternel et maternel dans notre tube, on a bien 4 brins différents, ce qui nous donnerait alors théoriquement 4^n-2*4*n quantité d'adn finale.  [...] Je pense qu'il parlait de l'établissement d'un profil génétique. En fait il s'agit de réaliser une PCR sur des marqueurs micro-satellites. Ces marqueurs sont des petites séquences (2 à 10 paires de bases) répétées en tandem. Ce qui varie n'est pas la qualité des nucléotides (bien qu'ils peuvent avoir quelques modifications) mais la quantité de répétitions.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ADN sur lame de paraffine

Je suis à la recherche d'infos pour optimiser mon extraction ADN à partir de lame tumorale incluse en paraffine. j'utilise un kit Qiagen. J'ai peu de tissu donc un rendement très faible ADN. 10 ug/ml. Ensuite la PCR de mon gène cible ne donne rien. Avez vous des trucs et astuce depuis le moment ou j'extrait de la lame jusqu'au moment ou j'élue pour augmenter ma quantité d'ADN purifié finale.  [...] Je ne connais pas ce kit mais il y a possibilité (si ce sont des colonnes) d'augmenter soit le rendement, soit la concentration en modifiant le volume d'élution, en faisant 2 élutions successives ou en utilisant du TE ou de l'eau a 40°.   [...]

SYBR green et BET (ou la non compréhension de la PCR en temps réel)

Dans la PCR classique, le BET n'est ajouté que lors du gel (directement dans le gel ou via un bain contenant du BET), il s'intercale dans les molecules d'ADN et fluoresce sous UV. Il permet une semi quantification car en général on revele en fin de reaction donc il s'agit d'une quantité finale.  [...] Mais peut être biaisé puisque la quantité finale dans ce cas n'est pas toujours relative a la quantité initialement présente. En effet après un grand nombre de cycle la Taq s'épuise, il y a moins de dNTP, plus d'inhibiteurs etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] accident... kit reverse transcription non conservé à -20°C

Tu peux toujours tester voir s'il fonctionne toujours (surtout vu le prix d'un tel kit) mais selon mon expérience certaines enzymes mais aussi les tampons qui sont avec fatiguent vite à température ambiante.   [...] Avec un peu de retard je vous réponds... Le kit fonctionne toujours mais le rendement paraît plus faible, la quantité d'ADNc finale est moins importante.  [...]

[Biologie Moléculaire] Calcul de rendement

En réalisant une électrophorèse sur la purification obtenue, on obtient les concentrations finales des fragments (dont le 5'gai de pCRgai, estimé à 5ng/µl, ce qui est peu), en comparant la luminosité des bandes.  [...] Je profite de topic pour vous demander autre chose. Je dois aussi réalisé une PCR. J'ai lu mon cours, le topic dessus sur Futura, mais je me demande quelque chose. Je dois faire un génotypage de plante, et je ne connais pas la concentration en ADN (donc en matrice).  [...]

AMORCE A adn

En fait une ARN polymerase suffit pour les fragments d'Okasaki alors que si on utilise une ADN polymerase, il faudrait davantage de contrôle, et surtout ça risque d'interférer avec la structure finale de l'ADN si plein de débris d'ADN pas faciles à dégrader s'intercalent.  [...] salut est ce que vous pouvez plus detailler la replication parceque je veux comprendre plus ce phenomene mais j arrive pas et merci d avance.   [...]

[Biologie Moléculaire] Gène Chevauchant ça veux dire quoi ?

Retiens juste que c'est pas noir ou blanc. En général, procaryote = ADN pas trop morcelé MAIS pas partout. C'est plus flagrant sur les gènes solitaires. autour d'eux, beh y'a pas mal de séquence non-codante. mais c'est rien comparé aux eucaryotes.  [...] Zoom sur gène. fragment d'ADN composé d'un promoteur (séquence non codante, non transcrite )+ succession d'introns (séquence non codante) et d'exons (séquence codante) toutes les 2 transcrites + un terminateur (séquence non codante, non transcrite).  [...]

[Biologie Moléculaire] Amplification infructueuse

J'utilise la Taq de invotrogen, mais dans leur protocol ils prennent un volume total de 100 microlitres, cependant pour le template ils disent juste 1-20 microlitres, (ce qui en soi est une fourchette assez élevée) et ne donnent pas d'indication sur la quantité d'ADN en ng optimale a prendre,  [...] j'ai essayé d'augmenter la concentration finale de MgCl2 comme dans le cas de non-produit ca peut etre du a une trop faible quantité de Mg, ducoup jsuis passé de 1.5 a 2.5 (meme si 1.5mM devrait etre suffisant normalement) j'ai aussi augmenté ma quantité de dNTP qui etait 5x inferieur a ce qui était préconisé de 0.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ADN ( ADN simple brin)

je sollicite votre aide, je suis entrain de mettre en place une technique d'extraction qui au final me donne de l'ADN simple brin... j'aimerai faire une purification sur colonne de silice, malheureusement j'ai l'impression que mon ADN n'est pas élué il reste accroché à la silice, car après avoir fait plusieurs real time en comparant ma technique avec une technique classique sur colonne de type Qiagen, les Cp sont très différent j'obtiens un Cp de l'ordre de 13 pour Qiagen et d'environ 20 pour ma technique.  [...] j'ai déjà fait plusieurs élutions finale jusqu'à 6 pensant finir par décrocher l'ADN mais cette expérience n'a pas été concluante.  [...]