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[Microbiologie] extraction d'ADN

j'ai fait l'extraction d'ADN au phénol chloroforme je me suis rendue compte à la fin de la manipulation que le culot est chargé également en protéines pourrais je me rattraper.  [...] s'il vous plaît mon encadreur m'a demandé de faire migrer les protéines SDS PAGE en puits confondus je ne sais même pas de quoi il s'agit je n'ai pas osé lui poser la question comment faire.  [...]

[Microbiologie] western blotting

j'ai fait migrer mes protéines par sds page en puits confondus, sur le gel les bandes sont nettes, en faisant le transfert sur membrane de nitrocellulose et après révélation par le 4 chloro1 naphtol je n'ai pas obtenu des bandes pourquoi à votre avis sachant que le transfert s'est bien passé j'ai dilué les anticorps primaires 1/100 et les anticorps secondaires 1/2000 je doute par rapport au titre des anticorps que j'ai utilisé sachant qu'ils proviennent des patients atteints de Mycoplasma pneumoniae qu'est ce que je dois faire.  [...] Le rouge ponceau est aussi pratique pour vérifier qu'il y a bien des protéines sur la membrane, les étapes de blocages peuvent parfois etre problématiques. J'ai parfois observé qu'un blocage plus court améliorait les signaux.  [...]

[Biologie Moléculaire] Migration SDS page en "sourire"

si tu as des puits en rab de chaque coté, dépose du tampon sans protéines (genre laemmli dilué comme si il y avait des protéines) dans chacun des puits libres de chaque coté. Idéalement, il faut centrer les dépots et combler les puits vides de chaque coté.  [...] 2) Si on laisse des puits inoccupés par un échantillon, les protéines des puits adjacents peuvent mal migrer, c''est ce qu'on appelle 'l'effet de bordure. Ce problème est facilement réglé en mettant simplement du tampon d'échantillon (1 X) dans ces puits inutilisés.  [...]

[Biotechnologie] Culture bactérienne et protéines recombinantes en plaque 96 puits

Je réalise déjà des tests d'expression de protéines recombinantes (sreening des meilleures conditions) mais en format tube...et ça prends beaucoup de place pour gérer la quantité d'échantillons. Habituellement, je réalise une étape de centrifugation à 15000g 30min 4°C en tubes, après la lyse bactérienne via un tampon de lyse commercial, pour séparer les fractions solubles/insolubles et analyser dans quelles fractions se trouvent la protéine produite (par SDS PAGE/WB/ELISA).  [...] Existe t-il un système permettant de séparer les fractions solubles/insolubles directement en plaque 96 puits. Est ce qu'il y a des utilisateurs qui ont l'habitude de faire de la production de protéines recombinantes en plaques.  [...]

[Microbiologie] extraction d'ADN

J'ai effectué une extraction d'ADN au phénol chloroforme après je m'aperçois que l'ADN n'est pas pur, autrement dit il y'a des restes des protéines et des lipides j'ai repris l'extraction à partir de phénol qui me permet de se débarrasser des protéines et le chloroforme pour éliminer les lipides, en mettant 2µL SUR GEL D'AGAROSE je n'ai pas obtenu de bande j'ai dilué le culot dans 50µl d'eau que dois je faire dois je prendre 6 µl de l'ADN sur gel ou bien dois je refaire la manipulation je n'ai pas envie de tout refaire je suis pressée mon encadreur m'a demandé de lui donner un compte rendu dans les plus brefs délais.  [...] merci pour votre collaboration pour le speedvac je pense que le principe est semblable à celui d'un lyophylisateur n'est ce pas sinon pour le sds page c'est quoi l'intérêt de faire des puits confondus pouvez vous m'envoyer une démonstration.  [...]

[Biologie Moléculaire] Causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

c'est vrai que ma question était très vaste d'ailleurs moi-même je n'ai pas de précisions, néanmoins pour le dernier problème je pense qu'il s'agit des tests sur l'homme c'est à dire qu'une protéine qui est efficace sur un modèle murin ne l'ai pas ou l'ai moins sur l'homme donc comment peut-on mieux l'adapter Mais encore une fois le prof n'a pas précisé le type de protéine, le vecteur ou le système d'expression (j'espère que j'ai été un peu plus claire).  [...] Logiquement, la grosse bande n'est pas encore présente sur gel pour cet échantillon. Donc tu peux voir ainsi, en comparant les deux puits, à quelle taille apparaît ta protéine (à supposer que tu ne la connaissait pas, ce qui semblait être ta question, même si c'est bizarre ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Sds-page

C'est la réponse à ton exam les trois propositions là La 1 c'est pas possible vu que les protéines dans les puits 2 et 3 n'ont pas la même taille (à moins que c'était la même protéine qui c'est pas fixée et qui a été clivée après mais j'en doute). Les 2 et 3 ok même si c'est la 2 la plus plausible si la bande est vraiment intense.  [...] Et les protéines de différentes tailles dans le puits 2 ça doit être tout simplement des protéines cellulaires qui ne se sont pas fixées et qui sont virées avec le PBS.  [...]

[Biochimie] Transfert western blot raté

Je souhaite induire une protéine à partir d'un système procaryote (en E.coli) grâce à l'IPTG. J'ai donc fait des tests d'inductions sur des petits volumes de culture (5ml). J'ai lysé mes bactéries puis déposé la fraction totale sur gel SDS-PAGE. Après coloration j'ai pu déterminer que ma protéine d'intérêt était induite (taille estimée 74 kDa).  [...] Bref, j'ai fait un transfert il y a 2 semaines avec un protéine purifiée...c'était magique. transfert impeccable, rouge ponceau OK et tout le reste aussi. Mais là je donne ma langue au chat, mon premier transfert était complètement de coté avec des bandes en zig-zag, on m'a dit qu'il devait y avoir une bulle qui a géné le transfert.  [...]

lyse des cardiomyocytes par tampon de lyse et dilution du lysat cellulaire en protéine

J'ai lysé mes cardiomyocytes par le tampon de Karla j'ai mis 1ml par puits d'un plaque de 6 puits mais proteinés sont diluées dans le tampon de lyse je ne sais pas comment les concentré.  [...] Avez-vous testé l'absence de peptides Il se peut aussi que la lyse ne soit pas effectuée correctement/complètement, ce qui limiterait fortement la diffusion des constituants du cytosol.   [...]

[Biologie Moléculaire] shifting sur sds-page anticorps

J'ai un petit problême avec des gels SDS-Page ( criterion precast gel, stainfree, 26 puits) migration dans tampon de migration et slb4X utilisé comme loading buffer.  [...] Je dis peut être une bêtise, mais ca me parait super haut comme poids moléculaire apparent pour des igG. Tu fais ta migration dans des conditions particulières.   [...]