• Forum - Protéine, Transfert, Sec

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Personnellement, j'ai transféré efficacement une protéine de 350 kDa mais ça marche uniquement avec les systèmes de transfert à sec. La bande de marqueur à 250 kDa était elle seulement partiellement transférée dans les systèmes liquides et totalement dans les systèmes à sec.  [...] Si après révélation tu as une tache là où tu as déposé ton échantillon, le problème est le transfert et dans ce cas il faut sans doute que tu trouves un appareil de transfert à sec vu la taille de ta protéine. Si tu n'as pas de tache, ça veut soit dire que ta protéine n'est pas là soit que ton anticorps ne marche pas dans les conditions où tu l'utilises.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot: Transfert incomplet

Jusque là tout va bien mais malgré un bon nombre d'essai je n'arrive pas à avoir un transfert complet de mes extraits protéiques sur ma membrane. Ma protéine fait 80 kDa et j'utilise un appareil de transfert liquide (Bio-Rad) avec des membranes de nitrocellulose.  [...] L'ethanol a le même effet que le méthanol Sinon je fait des gels a 10% et pour le transfert semi-sec, le probleme est que je n'ai pas d'appareil pour dans mon labo et si je me souviens bien c'est surtout conseillé pour les protéines de moins de 60 kDa non.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot brûlé

J'expose mon problème.. Dans le cadre d'un TP j'ai dû effectuer un Western Blot. Au moment où j'ai voulu récupérer ma membrane de nitrocellulose après transfert, il s'est avéré que tout à cramer./ La seule erreur de faite est que j'ai inversé l'anode et la cathode au niveau du générateur.  [...] Oui j'ai effectué un transfert semi sec. On devait réglé à 100mA constant et le voltage en début de transfert était de 16V.  [...]

[Biochimie] Extraction d'une protéine nucléaire pour WB

un conseil pour les grosses protéines comme la tienne, il est recommandé de faire un transfert sur la nuit (ca transfert tres mal).  [...] merci du conseil. J'ai déjà essayé de mettre au point le temps de transfert. En semi sec et avec l'appareil de transfert qu'on a (appareil bio-rad, petit gel, epaisseur du gel 1mm max) 1h de transfert fait passer les prot sur le papier wattmann. Mais peut être qu'a l'époque j'avais pas regardé si haut donc cela coute rien de remettre cela au clair.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Oui c'est ça je mets 3 membranes les unes sur les autres...et là j'ai des bandes bleues sur les 3 (les bandes de fin de migration) mais qd je les mets dans le rouge pinceau je vois aucune bande donc pas de transfert de protéine Ou un over transfert.  [...] Mon problème en ce moment c'est qu'après le transfert sur membrane mes bandes de protéine sont coulantes comme si on les avait frottés tout comme les bandes du marqueur de poids moléculaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot avec membrane PVDF

Je transférais mes protéines sur une membrane de nitrocellulose (transfert semi-sec avec Trans Blot Turbo System de Bio-rad) mais j'ai testé depuis peu la membrane de PVDF (même méthode de transfert). J'ai incubé mes membranes avec plusieurs anticorps primaires (toujours les même anticorps et 1 anticorps primaire/membrane).  [...] Cependant après révélation, je retrouve sur toutes mes membranes le même genre de motifs, des bandes très épaisses entre 60 et 80 kDa par exemple. A cause de ça je n'arrive pas a détecter la présence de mes protéines d'intérêt, les bandes étant noyées dans les plus épaisses.  [...]

[Biologie Cellulaire] Vesicule+manteau

Pour Jack Burner,je suis aussi en PCEM1 (même combat lol) protéine cargo c'est la protéine que tu vas transporter dans ta vésicule.Dans le cas de l'exocytose elle se fixe dans la partie cytosolique du recepteur de cargo(ou cargo membranaire) ce recepteur va permettre,par l'intermediaire d'un signal,de recruter les protéines du manteau.  [...] Mon doute(d'ailleur lazyboy,on en a déja parlé longuement lors d'une question que je t'ai posé à ce sujet.)est ce que la protéine transporteuse,dans le cas de vésicule de clathrine,capte,et ce autant dans l'endocytose(comme c'est stipulé dans mon cours)que l'exocytose,les protéines de manteau via UNE PROTEINE ADAPTATRICE(type AP/2 AP/1) lol.  [...]

[Biochimie] bruit de fond western blot

La seule contrainte c'est qu'il faut mouiller la membrane dans du méthanol avant le transfert. Mais sinon moi je n'utilise plus que ça.  [...] Je confirme, méthanol pour mouiller la membrane c'est mieux, il suffit de tremper dans quelques ml sous la sorbonne, 30 sec juste histoire de mouiller la membrane, rien de si contraignant... Ensuite on peut la mettre à équilibrer dans le tampon de transfert pour lequel on utilise de l'éthanol.  [...]

[Biochimie] Western blot

Selon si le transfert et semi sec ou non pourquoi il y a t'il des variations dans la composition de tampon des grosses variations parfois même il mettent un peu de SDS pour essayer d'augmenter le transfert mais bon.  [...] Les membranes de nitro sont tres hydrophobes, le passage en methanol permet de les mouiller si tu ne le fais pas tu n'arriveras pas a transferer tes proteines.  [...]

[Biochimie] Questions Coomassie et Western Blot

Le méthanol et l'éthanol rendent le gel plus poreux, ce qui permet de faciliter les échanges avec le tampon (que ce soit de transfert ou de staining en coomassie). Cela permet une meilleure pénétration du coomassie dans le gel pour colorer les protéines, et cela facilite la sortie des protéines du gel pour le transfert.  [...] Pour le transfert, les solvants ont un intérêt beaucoup plus forts car ils permettent la dissociation du SDS des protéines, ce qui permet aux protéines d'interagir avec la membrane de PVDF par interactions hydrophobes et électrostatiques, mais pas ioniques comme l'exigerait une interaction avec le SDS.  [...]