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[Biologie Moléculaire] Méthodes d'étude de l'ADN

Sur la seconde colonne, ce sont les protéines des cellules HelaAAVtCR-SC35GFP qui sont analysées. Ces cellules possède un virus AAV modifié et inactif (pour le moment) dans leur génome. De plus, une transfection stable a été réalisée pour ajouter la séquence codante (ADNc) de la protéine SC35GFP.  [...] Le but de cette était de vérifier la production de SC35GFP, et surtout vérifier son poids moléculaire ainsi que la quantité relative vis-à-vis de la protéine SC35 native. On a donc put en conclure que la protéine SC35 n'est pas trop sur-exprimé (2-3 fois plus dans les cellules SC35GFP+) et que cette sur-expression est stable dans le temps.  [...]

Vaccin VIH

Pourrait t-on réguler l'expression des gènes viraux Je pense notamment à l' ARN interférence, mais reste encore a trouver le vecteur. Est il possible de se servir d'un virus génétiquement modifié qui par exemple ne ciblerait que les cellules déjà infectées (en reconnaissant les protéiens virales à leur surface...).  [...] Le rôle de gp120 est, il me semble, de reconnaitre le CD4 des lymphocytes T, ce qui lui permet de s'internaliser dans ces cellules. Je suppose donc que HIV ne peut pas muter autant qu'il veut cette protéine sinon elle ne peut plus reconnaitre le CD4 qui lui reste stable (enfin le plus qu'il peut ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot : quelle unité ?

Sinon, je suppose qu'ils font une IP anti-His pour ne regarder l'ubiquitination que de leur protéine taggée. De très nombreuses protéines sont ubiquitinées dans la cellule, un blot anti-Ub donnerait donc un profil général n'apportant rien.  [...] Je le regarderais plus tard. Malgré que ce western ne soit pas beau, il est tout de même interprétable. la protéine est ubiquitinée au bout de 20 minutes et cette ubiquitination perdure au cours du temps, ce qui veut dire, si ces temps sont sur cellules, que l'ubiquitination en question n'est pas de type à adresser au protéasome (K48) et que l'ubiquitination est stable (non réversée par des déubiquitinases).  [...]

[biologie moléculaire] Probleme expression apres transfection stable

J'ai réalisé une construction en vue de l'expression d'une protéine en stable par des cellules HeLa. Le vecteur utilisé est le pIREShyg3, qui comme son nom l'indique contient.  [...] La construction a bien marché, le séquençage est OK, les cellules transfectées résistent à l'hygromycine (pas les cellules non transfectées contrôle), mais pas de trace de notre protéine, rien. alors que l'expression est importante avec un vecteur pCMV en transitoire.  [...]

proteine ou cellule stable ???

est ce que quelqun peut me dire ce que ça veut dire une protéine stable ou une cellule stable ou plutôt tel proteine se stabilise.  [...] Pour les lignées cellulaire, je comprends un lignée stable comme une lignée exprimant stablement une protéine d'intérêt. Il faut mettre en opposition les lignées stables au lignées transitoires. Je m'explique, dans le cas d'expression hétérologue d'une protéine dans une cellule eucaryote on peut soit.  [...]

lysat proteique

Si c'est juste verifier la presence d'une proteine et que le western donne une bande...pas de probleme, un premier blot donnera deja une indication.  [...] Tout depend aussi si la cible est une proteine stable ou fragile, si elle est presente en millions de copies (cytosquelette...) par cellule ou quelques copies (facteur de transcription...proteine regulatrice...).  [...]

[Biologie Cellulaire] Stabilité de l'ARNm

Quand tu veux exprimer une protéine dans une cellule, tu peux transfecter les cellules de manière à ce que ton ADN (plasmide le plus souvent) reste longtemps dans ta cellule. c'est la transfection stable. Tu as alors 2 possibilités. soit tu peux intégrer ton gène dans le génome cellulaire par recombinaison homologue, soit tu utilises des plasmides auto-réplicatifs qui ne s'intègreront pas (on appelle ça des épisomes).  [...] Enfin, la stabilité de ton ARNm produit dépend de son taux de production et de dégradation (c'est la même chose pour une protéine ou un ADN d'où la transition stable où il y a moins de dégradation de ton ADN). Plus un ARNm sera synthétisé dans de bonne condition, plus il sera stable, cad moins il sera dégradé.  [...]

[Biochimie] Interactions protéines

J'ai pu mettre en évidence (en culture cellulaire) que 2 protéines transmembranaires semblaient intéragir... Maintenant, je voudrais voir quels domaines de ces protéines pourraient intervenir dans cette intéraction... Le problème, c'est que j'y connais rien.  [...] En fait j'ai utilisé des cellules en suspension. J'ai fais des lignées stable exprimant mes protéines...(chacune d'elles sont taguée GFP ou DS-Red).  [...]

[Biochimie] Expression anormale d'une protéine exogène

Dans le cadre de mon travail de thèse j'utilise des cellules HEK que je transfecte avec un cDNA codant pour un canal. Il se trouve que ce canal doit naturellement se placer à la membrane plasmique. Les cellules que j'avais au début exprimait le plasmide au niveau de la membrane puis après quelque temps la protéine n'était exprimée que dans le cytoplasme.  [...] Tu fais une transfection stable ou transitoire Toute ta population de cellules est touchée par ce phénomène ou seulement une partie Toutes les protéines se retrouvent dans le cytoplasme ou une partie d'entre elles migrent quand même au niveau membranaire.  [...]

[Biotechnologie] Quelles protéines d'intérêt médicale ne peuvent être synthétisé qu'en cellule eucaryotes

Pour illustrer l'intérêt de la transfection stable d'un transgène dans une cellule de mammifère, j'aurais aimé trouvé un exemple de protéine d'intérêt médicale qui ne peut être synthétisées qu'en cellule eucaryote. J'avais pensé à l'insuline mais j'ai découvert que sa synthèse peut se faire dans des bactéries.  [...] La transfection stable permet de modifier le génome d'une cellule et de lui faire exprimer un gène d'intérêt, pas forcemment pour le produire en masse, mais plutôt pour l'étudier ou étudier son influence. Le seul inconvénient est que faire du stable n'est pas forcément évident et que ça ne fonctionne pas ou très mal pour certaines protéines mais ça reste des cas relativement rares et la plupart des gènes peuvent être transfectés en stable.  [...]