• Forum - Protéine, Intérêt, Fusion

Probème de smear sur gel d'électrophorèse de protéines

La protéine d'intérêt fusionnée en N-terminal à la GST a été exprimée chez E. coli puis purifiée sur résine cobalt (lavage en batch). La protéine de fusion a été clivée à la thrombine. La protéine d'intérêt est éluée par simple centrifugation. La protéine de fusion toujours accrochée à la résine est éluée avec de l'imidazole.  [...] Ok, donc si vous êtes sûr que votre protéine d'intéret est bien produite. Les smears sont en géneral dûs á une mauvaise préparation d'un des deux gels (ou des deux) ou encore au dépot d'un volume trop grop de protéines dans les puits du gel.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

On veut donc fabriquer cette proteine de fusion qui est composé de deux domaines correspondant chacun a l'une des deux proteines d'interet et reliés entre eux par une liaison peptidique. Si elle se replie bien alors la proteine exprimera les deux propriétés (cool ).  [...] Ca dépend. Vu que tu fais une protéine de fusion, tu ne peux exclure que le domaine GFP ne gêne la protéine d'intérêt (par encombrement par exemple). Dans ce cas tu peux essayer les deux types de construction, voire insérer un linker entre les deux domaines afin de les espacer un peu.  [...]

Ciblage de cellules de mamifères

Si certaines cellules aux caractéristiques particulières (surexpression de récepteurs,...) manquent d'une protéine X, est-il possible de faire rentrer cette protéine X dans des cellules de mammifères particulières in vivo (nanoparticule ).  [...] Dans le détail, la protéine d'intérêt est fusionnée à la protéine gag de HIV par l'intermédiaire d'un site protéolytique ce qui permet la libération de la protéine après fusion de la particule avec la cellule d'intérêt. En théorie, le choix des protéines d'enveloppe de la pseudoparticule permettent un adressage à différents types cellulaires.  [...]

[Biologie Cellulaire] Marquage GFP

si tu couples ta protéine d'intéret à la GFP, tu peux la suivre dans la cellule, qd elle se ballade du noyau au cytoplasme par exemple.  [...] Tu n'introduis pas la GFP seule, mais un gène codant une protéine de fusion GFP. Ainsi, ta protéine d'intérêt et la GFP étant lié covalement, en suivant la localisation de la GFP tu suivras la localisation de ta protéine d'intérêt.  [...]

[Immunologie] Fixation pour immonofluorescence

Par contre ils restent visibles dans les cellules transfectées avec les plasmides contenant mes gènes d'intérets. J'ai peur que les méthodes de fixations utilisées n'entrainent une relocalisation cellulaire de mes protéines.  [...] Le plasmide vide signifie qu'il n'y a que la GFP. Donc la GFP est exprimée seule, pas en fusion avec la protéine d'intérêt. Cela fournit un contrôle indispensable pour montrer que les conditions utilisées n'affecte pas la localisation de la GFP, et donc prouver qu'une relocalisation éventuelle de la protéine de fusion GFP-X est spécifique de la protéine X.  [...]

fusion transcriptionnelle et traductionnelle

la fusion traductionnelle est une fusion de gênes effectuée dans leur partie codante et respectant les cadres de lectures. Permet d'obtenir une protéine chimère. cette technique permet par exemple de faire une fusion entre un gène d'intérêt ( qui code pour une protéine d'intérêt ) et le gène qui code pour la GFP.  [...] à propos d'une fusion traductionnelle, j'imagine qu'on peut l'utiliser pour isoler une protéine d'intérêt ou bien réaliser une fusion entre une protéine d'intérêt et la GFP ( pour visualiser et localiser le chemin emprunté par la protéine dans la cellule ) je me trompe.  [...]

[Biologie Moléculaire] fusion traductionelle

Je me demandais combien de temps il faut en general pour faire une fusion traductionelle sur le chromosome d'une proteine d'interet (essentielle) avec GFP (ou autre fluorophore peu importe).  [...] J'ai un phenomene interessant avec E. coli que je soupconne d'etre conserve chez toutes les especes, et je voudrais verifier ma theorie chez les eucaryotes (levure et mammifere).  [...]

Méthode de marquage - HaloTag

Si j'ai bien compris la brochure, en gros au lieu d'avoir une GFP comme protéine de fusion, c'est le Halo tag qui est couplé à la protéine d'intérêt. Le principe a l'air assez simple, en gros on peut ensuite coupler n'importe quoi sur le Halo (billes, biotine, fluorophore.  [...] ..). Ce qui fait qu'on peut l'utiliser pour localiser la protéines d'intérêt dans un tissu ou une cellule avec la fluo, mais aussi coupler avec des billes pour faire un réaction biochimique, ou encore fixer la protéine sur une lame de verre, le tout sans devoir recommencer le clonage à chaque nouvelle application.  [...]

Phage display et banque d'ADNc

Le principe c'est de faire exprimer la protéine à la surface du bactériophage et puis d'isoler les bactériophages qui expriment la protéine d'intérêt à l'aide d'Ac (et pour réaliser ca, on fait des protéines de fusion).  [...] Dans le phage display, ce qu'on a fait c'est que cet ADNc est fusionné avec l'ADN codant une protéine de surface du virus. De ce fait la protéine codée par cet ADNc va se retrouver exposée à la surface.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification d'un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose

Donc en gros, je fais migrer un echantillon contenant la proteine toxoplasmique P30 par SDS-PAGE puis aprés transfert, saturation et incubation avec un serum (à purifier) je coupe une portion de la membrane qui correspond a la proteine d interet et j utilise un tampon d elution pour eluer les anticorps a partir de la membrane.  [...] Dans le periplasme de Ecoli se trouve ma proteine d interet la p30-AP (proteine de fusion couplée a la phosphatase alcaline et la phosphatase endogéne ) la p30 a un phi de 6 et la AP de 4.5. Aprés plusieurs essai j ai pu separer la p30-AP de la AP endogéne ce qui est deja pas mal mais la p30 precipite en natif et reste a la base du puit.  [...]