• Forum - Protéine, Bactéries, Plasmide

[Biochimie] Nickel et congélation ...

Ce peptide forme des corps d'inclusion justement d'où l'utilisation d'urée aussi pour les récupérer. En fait j'ai testé plusieurs choses et il faut que je recoupe tout ça. J'avais testé avec de la guanidine aussi mais là je retrouve mon peptide dans le culot après la lyse des bactéries.  [...] Sinon, plutot que d'éviter à tout pris que ta protéine ne s'agrège... pourquoi ne pas utiliser cette caractéristique comme moyen de purification.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Il est possible d'obtenir de grande quantité de protéine en le faisait produire par des bactéries ayant reçu le plasmide recombinant contenant le gène cible.  [...] Se pose aussi le problème des modifications post traductionnelles, et dans ce cas on essai dans des levures humanisées par exemples (après tout dépend de ce que tu veux faire avec ta protéine. etudes structurales, fonctionnelles ou production pharma). Et en effet pour l'expression en bactéries on utilise un plasmide qui reste sous cette forme, il ne s'intègre pas dans le génome.  [...]

[Microbiologie] transformation bactérienne

On transforme avec un plasmide qui contient en général plusieurs gènes. Un gène de résistance pour sélectionner les bactéries transformantes, et un gène d'intérêt (pour l'expression d'une protéine par exemple).  [...] Rien ne nous empêche de transformer une cellule bactérienne avec plusieurs vecteurs, ou d'insérer sur un même vecteur plusieurs gènes d'intérêt. Mais votre question nécessite quelques précisions.  [...]

Les colonies satellites dans un milieu aditionné d'Ampicilline

Oui c'est correcte maintenant. j'ai compris que le but d'ensemencer ces cellules transformées dans le milieu LB+Amp est justement pour les sélectionner, parce que j'arrivais pas à trouver le rapport (milieu ampicilline/bactéries sensibles)... mais je vois que c'est un cas particulier pour l'ampicilline, puisqu'il a un pouvoir bactériostatique, les bactéries sensibles peuvent également pousser donc ici c'est les cellules satellites qui sont sensibles à l'ampiciline et qui portent la construction plasmidique.  [...] Dans un transformation classique (que ce soit avec des cellules électrocompétentes ou avec des chemocompétentes), tu dois laisser 1h tes bactéries dans du LB liquide (le temps que les bactéries qui possèdent le plasmide puissent exprimer la protéine donnant la résistance).  [...]

[Biologie Moléculaire] Proteines recombinantes

Je ne comprends pas comment on peut utiliser les plasmides pour produire des protéines pour l'utilisation médicale par exemple l'insuline (on tire profit de l'opéron lactose). Comment est-ce qu'on force les bactéries à garder le matériel génétique introduit et comment ça se fait qu'il y a une partie des bactéries qui n'est pas transformé par le plasmide (qu'est-ce qu'on fait avec cette partie).  [...] Les protéines n'ayant pas intégré le plasmide vont donc crever, on ne fait rien avec. Pourquoi toutes les bactéries n'intègrent pas le plasmide Pas vraiment de réponse, ça dépend de beaucoup de choses, c'est un peu comme les transfections pour les cellules eucaryote, tu n'as jamais 100% d'intégration et tu dois valider tes transfections.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

J'ai transformé des bactéries DH5alpha avec mon plasmide GST et mon plasmide GST-prot d'intérêt. Pour chaque transformation j'ai effectué un contrôle non induit. J'ai testé deux stragégies d'induction avec 1 mM IPTG. 2h à 37°C ou toute la nuit à 30°C.  [...] De la même manière j'ai co-migré un extrait protéique obtenu après transformation des bactéries avec un pGEX vide et là aussi la colonne reste entièrement vide. Ces contrôles signifient bien que mon anticorps ne marque pas une protéine bactérienne endogène ou un bidule provoqué par l'insertion du seul plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Préparation de plasmide, chloramphenicol

2. Et puis, je ne comprend pas trop pourquoi le chloramphenicol tue les bacteries. D'apres ce que j'ai lu, ca bloque la proliferation des cellules mais ca ne devrait pas les tuer. Une hypothese. en bloquant la synthese proteique, estce que le chloramphenicol ne rend pas les bacteries plus sensibles a l'ampicilline (le plasmide porte le gene de resistance a l'ampicilline, on cultive donc les bacteries en presence d'ampicilline, mais en concentration deja faible (50mg/mL)).  [...] 3. Et puis autre question, j'ai egalement lu que l'origine de replication colE1 pourrait necessiter un cofacteur bacterien tres instable. Cultiver des bacteries avec ce plasmides en presence de chloramphenicol ne devrait donc pas permettre d'augmenter le nombre de copie par cellules, puisque si la synthese de proteine est inhibee, le facteur en question n'est pas renouvele, donc le plasmide n'est pas replique.  [...]

[Biochimie] Manipulation de l'ADN: plasmide

je suis actuellement en première année de licence en biologie et nous avons étudié les plasmides mais je n'ai pas tout compris notamment sur la carte de réstrction. Quelle est son principe et qu'est ce qu'un site de réstrction, une origine de réplication, un promoteur et un terminateur.  [...] Le plasmide étant constitué d'ADN tu as besoin d'une origine de réplication afin de permettre aux polymérases de le reproduire dans la bactérie. Si le morceau d'ADN ajouté code pour une protéine, la présence d'un promoteur et d'un terminateur te permettra d'activer la production de la protéine à partir du plasmide.  [...]

[Microbiologie] bacterie resistantes

je dois cultiver des bactéries possédant un plasmide de résistance à un antibiotique. Dans le bouillon, je dois mettre cet antibiotique. Je ne comprends pas pourquoi puisque les bactéries sont résistantes Pouvez m'éclairer.  [...] - Au cours des divisions cellulaires, le plasmide peut ne pas être transmis à certaines bactéries filles, il y aura donc apparition de bactéries non résistantes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Amplification et purification de plasmide

Les culots de bactéries je les trouve pas énormes mais j'ai peur de saturer les colonnes de purif avec trop de bactéries si je dilue moins la préculture, ou trop de plasmides en utilisant du chloramphénicol. Je vais refaire la manip cette semaine en eluant avec un plus grand volume d'eau et en précipitant à la fin pour reconcentrer mon plasmide et je verrai bien si j'en ai plus cette fois.  [...] De deux choses l'une. soit ta combinaison plasmide/bactérie donne un faible rendement, soit ta technique de purif ne marche pas. Je te conseille de garder un aliquot (1.5ml) de tes bactéries avant de les lyser pour ta prep sur colonne. Fais une miniprep classique sur cet aliquot (lyse alcaline + isopropanol) et estime ton rendement en plasmide.  [...]