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[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Cependant, si tu arrives à transférer des bandes plus lourdes que ta protéine, ton problème ne vient probablement pas du transfert à moins que taprotéine ait une composition en acides aminés très atypique (c'est rare pour une protéine géante). Il faudrait donc être certain que la protéine que tu cherches est bien présente et que ton anticorps la reconnait efficacement dans les conditions ou tu l'utilises.  [...] Le dot blot marche donc c'est plutôt bon signe, même si ça n'exclue pas tous les artefacts possibles liés à ton anticorps. S'agit-il d'un anticorps polyclonal ou monoclonal directement dirigé contre ta protéine ou d'un anticorps dirigé contre une étiquette que tu as ajouté Quand tu utilises cet anticorps, tu ne vois pas ta protéine mais vois-tu d'autres bandes plus petites ailleurs sur le gel Si tu vois des bandes plus petites, s'agit-il d'une bande unique (dans ce cas, il s'agit probablement d'une reconnaissance non spécifique d'une protéine qui n'a rien à voir) ou de plusieurs bandes et en particulier de bandes proches les unes des autres (dans ce cas c'est sans doute une dégradation partielle).  [...]

[Biologie Moléculaire] Utilisation de la trypsine pour un test de repliement des protéines

Je viens de découvrir une nouvelle méthode qui consiste à traiter des extraits cytoplasmique avec de la trypsine (1, 3, 10...µg/ml) pendant 5 min, faire un western blot avec un anticorps pour la (les) protéine(s) d'intérêt et regarder si les bandes observées sont à hauteur attendue (bonne taille en KDa), ou avec des tailles inférieures ou si elles ont complétement disparu.  [...] Si les protéines sont résistantes à un traitement à la trypsine à forte concentration c'est qu'elles sont bien repliées et donc moins accessibles à cette protéase.  [...]

Mapk P38

Hello est ce que quelqu'un a déjà essayé de différencier par un Western la protéine P38 et cette même prot sous forme phosphorylée En gros est ce que je peux mettre mes deux anticorps primaires en même temps et voir apparaître 2 bandes Je fais des gels d'électrophorèse à 12%, est ce que la résolution est assez forte.  [...] Si ta proteine est multiphosphorylée oui tu peux faire ca, normalement les proteines phosphorylées migrant plus lentement tu observera des bandes superieures. Il faut etre sur que les bandes inferieures ne sont pas des produits de degradation (donc un témoin traité a la phosphatase alcaline est essentiel).  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

Dans un deuxième temps j'ai produit un anticorps reconnaissant cette protéine et j'ai fait un western avec l'anticorps purifié. J'observe alors une bande au bon poids et d'autres plus petites (ne fait pas une smire, il n'y a que 3 bandes de plus).  [...] Un anticorps en western blot donne rarement qu'une seule bande, sauf si l'on dépose la protéine recombinante. Donc qu'as-tu déposé, des extraits (de tumeurs, de cellules surexprimant ta protéine après transfection d'une construction la codant,...), la protéine recombinante.  [...]

[Biochimie] le native PAGE !! et western blot "natif"

en effet j'ai une proteine positive à faire migrer pour cela j'avais inversé les bornes lors de l'electrophorèse afin qu'elle puisse migrer tranquillement vers le moins et pareil lors du transfert (sauf que la j'avais inversé la membrane et le gel) et le resultat à la fin est assez surprenant vu que mon anticorps semble detecter quelque chose mais ca ne donne pas des bandes mais on dirait juste une membrane degueu.  [...] Une photo pourrait peut être aider, c'est difficile a dire sans voir tes résultats, même si tu précise que c'est moche, c'est mieux de voir moche comment.   [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

A la révélation, je n'ai aucune bande ou au contraire quelque fois j'ai des bandes intéressantes mais qui ne correspondent pas à la taille de la protéine (250kDa). (L'anticorps utilisé est celui qui est le plus abondant dans les publications).  [...] La protéine apparait autour de 100kDa au lieu de 370kDa. Je voulais savoir si quelqu'un avait déjà ce problème avec cet anticorps.  [...]

[Biochimie] Ratio de Western Blot

En western blot, après quantification, on ne peut comparer deux bandes entre elles que s'il s'agit de la même protéine, révélée par le même anticorps primaire et secondaire et que la quantification est normalisée par le témoin de dépôt.  [...] Pour ton exercice, tu ne précises pas si les bandes comparées concernent la même protéine donc difficile de te répondre. Est-ce que le témoin E-cadherin bouge entre les deux pistes.  [...]

dégradation de protéine recombinante

Je rencontre actuellement un problème lors de l'expression et la purif d'une prot recombinante. j'utilise le vecteur d'esxpression pQE30 et je purifie sur colonne NI-NTA, mais voila lorsque que je charge le produit de ma purif sur gel SDS j'observe bien la protéine d'intérêt à la MM attendue mais également des bandes de MM plus basse.  [...] La seule chose que je peux dire c'est que lorsque je fais un immunoblot avec un anticorps anti-histidine je n'observe que ma protéine d'intérêt mais cela n'exclue pas que la protéine ait perdu son étiquette histidine lors de sa dégradation et que les bandes observées par coloration au nitrate d'argent ne soient pas ds formes de dégradation.  [...]

Quel test statistique utiliser?

Je cherche a détecter une différence significative du niveau d'expression d'une protéine entre des cellules transfectées et non transfectées. Pour cela, j'ai réalisé un lysat cellulaire, et fait migrer mes protéines. J'ai par la suite comparé le niveau d'expression de cette protéine en question par mesure de l'intensité des bandes.  [...] Ainsi je possède deux bandes, l'une de la protéine ds cellules transfectées et l'autre de la protéine des cellules non transfectées. Je voudrai maintenant savoir s'il existe unedifférence significative entre ces deux bandes... Est- ce faisable.  [...]

résultats WB

j'ai réalisé un Western blot (pièce jointe) et les résultats sont bien ceux auxquels je m'attendais mais je voulais savoir à quoi correspondait les légères petites bandes qu'on peut apercevoir un peu partout est ce un fixation non spécifique de l'anticorps utilisé.  [...] L'anticorps va toujours réagir avec des protéines dont il n'a que peu d'affinité. Si la saturation ou le rinçage n'est pas suffisamment stringent, on garde des bandes non spécifiques (et si le rinçage est trop stringent, on risque de diminuer l'intensité du signal recherché).  [...]