• Forum - Produit, Amplification, ADN

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

As-tu déjà essayé de purifier ton ADN avec un kit de purification de produits de PCR J'avais commencé mes clonages avec un kit de purification sur gel. Le problème est que le rendement de ce genre de kit est souvent faible. Cela occasionne une grosse perte de matériel, surtout au bout de 3 ou 4 purif.  [...] L'amplification par PCR va donner des amplicons non méthylés (et aussi ne contenant plus ta cassette vu que l'amplification du vecteur exclura la cassette). Tu ajoutes à ton produit de PCR l'enzyme DpnI qui va cliver l'ADN méthylé en fragments de quelques centaines de bases (enzyme de restriction reconnaissant un site de 4 bases méthylé).  [...]

[Biologie Moléculaire] Connaissez -vous un outil d'analyse d'affinité d'un primer pour une séquence ?

Bien, (rappelez-vous que ma molécule d'ADN est simple brin) je travaille actuellement à une expérience d'amplification par cercle roulant (rolling-circle amplification, RCA).  [...] Mais j'obtiens bien un produit de RCA (observé contre un controle sans molécule template d'ADN = aucune amplification) avec l'une ou l'autre amorce alors que sans le Forward primer, la réaction n'est pas censée se produire avec le Reverse primer seul.  [...]

[Biologie Moléculaire] Nested PCR

Je souhaite réaliser une Nested PCR afin d'identifier un évènement très rare dans mon échantillon. Mes premiers essais montrent une amplification très faible. Y a t'il un problème à réaliser une Nested sans dilution (Ni diluer l'extrait d'ADN, ni le produit de la première PCR) Est-ce que je ne risque pas d'obtenir des produits non voulus.  [...] Normalement vous ne devriez pas avoir de résultat indésirable sauf en cas de contamination ou un problème de programme au niveau de la température d'hybridation.   [...]

[Biologie Moléculaire] PCR : migration après amplification (sans digestion enzymatique)

Là je ne suis pas sure de moi du tout. est-ce que pour la colonie bleue il n'y a pas de produit d'amplification et pour la colo blanche il y en a un de 240 pb Je trouve ça illogique car la PCR amplifie l'ADN, or la colonie bleue même sans insert contient bien un plasmide donc de l'ADN.  [...] OU BIEN. est-ce que pour la colo bleue a un produit d'amplification de 3900 pb et la blanche un produit d'amplification de 4140.  [...]

Utilité de la PCR en médecine ?

Sans amplification on ne pourrait pas détecter l'ADN viral qui est en concentration trop faible (enfin ça change, maintenant je crois qu'on peut le faire).  [...] Un peu plus subtil. on peut aussi mettre en évidence une mutation non pas juste sur amplification ou pas, mais sur la longueur de l'ADN amplifié. par exemple, ton produit PCR d'un ADN normal serait de 150 pb alors que celui d'un ADN muté serait de 120 pb, et ça tu peux le voir sur gel d'électrophorèse.  [...]

mix pcr

après ma pcr, et pendant que je mesurais les DO, je me suis rendue compte que j'ai oublié de mettre mon mix pcr dans un seul de mes échantillons, l'amplification n'a pas eu lieu évidement, est ce que je peut toujours réutilisé ce produit, c'est le dernier qui me reste, sinon je vais devoir tout recommencé à 0.  [...] oui c'est vrai, j'ai essayé d'ajouter un mix à mon extrait de pcr et de relancer, il semble qu'une amplification a eu lieu cette fois ci, j'ai une concentration de 2600ng/µl et un rapport 260/280 de 1.6, cependant j'ai un doute est ce que c'est mon adn qui a été amplifier ou bien c le produit de mes propres amorces.  [...]

[Biologie Moléculaire] RT-qrt-PCR : courbe de fusion et autres contrôles

A quoi sert de vérifier le Tm de l'échantillon Une chute massive signifie un Tm unique donc un seul produit d'amplification.  [...] Le principe, c'est que la vitesse d'amplification du produit (en phase expo) varie dans le même sens que la quantité d'ADNc présent dans l'échantillon. en quoi cela m'indique quel est le problème des dimères de primers et le rôle des différentes dilutions.  [...]

Pcr

Des concentrations élevées en ADN polymérase peuvent causer l'amplification de produits non spécifiques ou l'échec total de la réaction.  [...]

rDNA ou rRNA?

L'amplification a partir du rDNA me semble avoir plus d'avantage qu'a partir du rRNA. L'ADN est plus stable, moins degradés, ensuite il n'y a pas de RT necessaire, une etape en moins, sans parler de l'extraction d'ADN qui est souvent plus facile a faire.  [...] Sinon pour l'extraction, par exemple pour un profiling de bacteries, lorsque tu veux determiner quelles especes sont presentes a tel endroit, en fait tu extrais l'ADN total de tes bacteries, et apres tu fais une PCR (amplification de l'ADN) avec des amorces universelles des 16S des bacteries.  [...]

[Biologie Moléculaire] Amplification PCR

La PCR emboîtée utilise comme matrice le produit d'une première PCR et des amorces hybridant en 3' des amorces utilisées pour la première PCR. Ainsi tu augmente la spécificité de l'amplification puisque tu forces le système d'amplification a être spécifique de ton gène.  [...] En effet, si la première PCR donne un produit non spécifique, avec la PCR emboîtée, il y a peu de chance pour qu'il y ait amplification du non spé.  [...]