• Forum - Production, Protéine, Fusion

Proteine de Fusion Besoin d'aide

bonsoir a tous, j'ai un exercice a faire concernant la production d'une proteine de fusion, GFP-GST.  [...] j'ai donc utilisé les enzymes de restriction coupant au niveau du sites EcoRI de pGEX. afin d'inserer mon gène EGFP qui possède dans sa partie MCS, un site de restriction EcoRI egalement. mais je ne sais pas comment couper, apres le gène EGFP pour qu'il soit complementaire de la sequence de l'extremité colante correspondante sur pGEX.   [...]

[biologie moléculaire] Opéron lactose

L'IPTG est utilisée notement en biotechnologie dans les cas de productions de protéines recombinantes par un vecteur d'expression que l'on fabriquera avec un gène d'une protéine fusion (le gène lacZ ds ce cas ci) qui permettra une lecture du gène controlée et donc une production controlée de la protéine cible.  [...] C'est interressant car cela permet d'optimiser la production de la protéine recombinante en commencant la production apres une période de développement et de division de l'organisme hote.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pull down GST

J'ai quelque souci de production de la protéine, j'arrive en avoir mais à des quantités pas très élevée. Sauriez-vous combien il faut de proteine en fusion avec la GST sur les billes pour faire le test pull down.  [...] Si ta production n'est pas très grande, attention toutefois à la quantité de billes nécessaire, car plus il y a de billes, plus tu augmentes la possibilité d'intéractions aspécifiques avec les billes. Ta protéine est elle soluble Car il se peut aussi qu'elle soit produite en grande quantité, mais non solubilisée dans le tampon d'extraction.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

3. Pour mieux cerner ton problème, tu commences par répéter ton protocole de production en utilisant le vecteur vide au lieu de ta construction. La GST est une protéine très facile à produire donc tu en auras des tonnes si ton protocole est correct. Rend toi au 4 si tu as beaucoup de GST, sinon rend toi au 7.  [...] 7. Si tu n'arrives pas à produire la GST seule, c'est ton protocole de production qui a un problème. Essaie un autre protocole avec le vecteur vide d'abord puis une fois que ça marchera tu essaieras avec ta protéine de fusion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine de fusion

Mettre une séquence IRES entre les deux ADNc revient à faire un ARNm bicistronique en effet, donc un ARNm de fusion si on veut, mais deux protéines bien distinctes après traduction.  [...] Pour faire une protéine de fusion AB, il te suffit simplement de mettre la séquence codante de B juste à la suite de celle de A. Il faut juste enlever le codon stop à la fin de la séquence de A (sinon tu ne produiras que la protéine A). Tu vas alors obtenir un seul ARNm qui sera traduit en protéine AB.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

PinPoint. The PinPoint™ Xa Protein Purification System is designed for the production and purification of fusion proteins that are biotinylated in vivo.  [...] Ce vecteur ne sert donc pas à produire n'importe quelle protéine mais à mettre les séquences qui vont permettre de promouvoir la transcription du gène rapporteur luciférase.  [...]

Protéine de fusion recombinante dimérique, besoin d'aide.

Pour une protéine de fusion, les deux séquences codantes sont mises à la suite l'une de l'autre sans codon stop entre les deux. une seule chaîne est produite.  [...] Si l'écotine se dimérise, il suffit de faire un seul vecteur avec un gène fusionnant écotine et proinsuline, et la dimérisation de cette protéine de fusion se fera spontanément via le domaine écotine.  [...]

Phage display et banque d'ADNc

Le principe c'est de faire exprimer la protéine à la surface du bactériophage et puis d'isoler les bactériophages qui expriment la protéine d'intérêt à l'aide d'Ac (et pour réaliser ca, on fait des protéines de fusion).  [...] Mais du coup, si une banque, c'est plein d'ADNc différents, on fait des protéines de fusion avec tous les ADNc différents et du coup le phage va exprimer en protéine tous ces ADNc Et après on fait la sélection.  [...]

[Biologie Moléculaire] Disparition inexplicable

C'est un peu délicat, car on ne dispose pas d'anticorps contre cette protéine dans la communauté. Aussi on utilise un anti-GFP. Le hic c'est qu'en western je vois ma protéine de fusion au poids attendu (poids de la protéine + poids du GFP), mais chez ces souris la fluorescence sanguine était encore présente, donc il n'y a pas de soucis pour elles.  [...] Tu pourrais donc voir si l'acidification de tes cellules qui expriment encore ta proteine de fusion a les memes consequences. Quand tu aurra trouvé vraiment à quoi c'est du, je serai curieux de le savoir.  [...]

Technique

dans le GST, il faut un tag GST, donc une protéine de fusion. Dans l'IP, pas besoin de protéine de fusion, on peut le faire sur une protéine native, mais il faut un anticorps spécifique.  [...] De la, on peut dire que le GST est universel mais nécessite de faire une protéine de fusion, alors que l'IP on peut la faire en conditions physiologiques, mais il faut un anticorps spécifique qui fonctionne. etc.  [...]