• Forum - Pression, Sélection, Cellules, Plasmide

[Biologie Moléculaire] siRNA, shRNA ??

Bien sûr mais la pression de sélection ne permet que de sélectionner les plasmides intégrés et les plasmides épisomaux répliqués. Dans ce dernier cas, il leur faut une origine de réplication exploitable par la cellule transfectée, comme par exemple un plasmide contenant l'origine de SV40 avec les cellules COS-7 qui possèdent l'antigène T nécessaire pour répliquer les plasmides contenant cette origine.  [...] Oui je rejoins LXR sur ce point, en dehors du cas bien particulier des vecteurs épisomaux, la pression de sélection va permettre de selectionner les cellules qui ont intégré le plasmide, sinon celui-ci est perdu au fur et à mesure des divisions cellulaires.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Sur beaucoup de plasmide si tu ne maintient pas de pression de sélection le plasmide est perdu très rapidement et au final tu vas regarder des cellules sans plasmide.  [...] Pas besoin de sélectionner si c'est du transitoire, en revanche il faut s'assurer que les meilleures conditions ont été choisies pour voir une expression, tu transfectes les cellules auquel cas, il faut tester plusieurs conditions de transfections, différentes quantités de vecteurs avec différentes quantités en excès de lipofectamine ou autre transfectant, car tu es peut-être dans des conditions ou tu ne transfectes pas beaucoup, puis tester l'expression à 24h et 48h post-transfection comme l'a proposé Yoyo.  [...]

Plasmides et Mycoplames

Ma question est la suivante. est-ce que les mycoplames auraient pu intégrer le plasmide et de ce fait masquer une hétérogénéité lié au fait qu'il s'agisse d'un pool cellulaire Je précise que la pression de sélection est maintenue en permanence.  [...] j'aurai plutot tendance a penser que le probleme reside dans la technique de decontamination et que c'est elle qui a affectée l'expression de ton gene rapporteur (et sans doute d'autres genes).  [...]

[Biotechnologie] RNA interference : siRNA, shRNA

En culture cellulaire, si le vecteur est un plasmide, il ne s'intègre pas dans le génome mais peut se répliquer. Cependant il risque d'être expulser si il n'y as pas de pression de sélection comme une résistance à un antibiotique. Le moyen le plus sure de faire une lignée stable est d'utiliser un vecteur lentivirus, qui intègre la séquence du shRNA (ou de n'importe quel gène) dans le génome.  [...] En effet le shRNA a besoin d'un promoteur et d'autres séquences pour s'exprimer (moins ready to use que le si). On peut effectivement l'intégrer dans un vecteur adénoviral (qui ne s'intègre pas. effet transitoire) ou lentiviral (qui s'intègre, donc effet stable si on utilise une sélection des cellules ayant intégré le vecteur) ou AAV.  [...]

Stratégies d'insertion de fusions de gènes

pour repondre a ta question, je ne vois pas pourquoi tu parles de disruption, puisque l'on peut tres bien faire de l'integration ciblée sans disrupter un gene ou sans en alterer son fonctionnement. In fois l'insertion effectuée, celle-ci est stable il n'y a donc pas besoin de maintenir la pression de selection.  [...] Pour que l'insertion soit stable, comment tu fais si tu ne maintiens pas la pression de sélection notamment dans le cas d'insertion via des transposases J'arrive à comprendre qu'une insertion via un plasmide vecteur et recombinaison homologue reste stable, mais le propre de l'élément transposable n'est-il pas justement de transposer La cellule a t-elle intérêt à maintenir une insertion qui ne lui apporte rien (c'est un peu finaliste comme question, mais c'est vrai.  [...]

[Génétique] Conséquence de l'intégration d'un vecteur dans une bactérie

Seule exception. quand on transforme une souche avec un plasmide, il faut la laisser un moment (45 minutes il me semble) en milieu non sélectif, pour qu'elle ait le temps d'exprimer la protéine de résistance. Mais elle n'a alors pas le temps de se diviser et de perdre le plaqmide.  [...] Cela ne l'est pas dans une population de milliards de milliards de cellules se reproduisant vite, une petite différence au départ peut conférer finalement un avantage non négligeable. Sans parler des questions de plasmide multi-copies. C'est un principe général, on enlève la pression de sélection, le gène de résistance subit la dérive, voire même est contre-sélectionner si son maintien/ expression a un coup.  [...]

proteine ou cellule stable ???

i) transfecter avec un plasmide qui contient le gène d'intérêt, puis effectuer sa manip sur les cellules (dans ce cas, toutes les cellules n'exprimeront pas la protéine, et celles qui le font, élimineront en quelques génération le plasmide).  [...] ii) transfecter stablement avec un plasmide qui contient le gène d'intérêt et un gène de résistance, on ajoute un agent de sélection, donc seuls les cellules qui possèdent le plasmide survivent, et au final, il y aurait intégration du plasmide dans le génome.  [...]

[Biotechnologie] Antibiotique(s) autorisé(s) en tant qu'ingrédient en fermentation industrielle

Est-ce que quelqu'un sait si l'utilisation d'antibiotiques est légalement autorisé en fermentation industrielle d'un OGM (E.coli + plasmide surexprimant un gène particulier mais qui nécessite une pression de sélection, l'antibiotique idoine) Si oui quel est-il ou quels sont -ils.  [...] A l'heure ou nous rencontrons des difficultés avec les bactéries multirésistantes (BMR), je suppose que les antibiotiques sont proscrits en tant qu'ingrédient industriel chez les producteurs de molécules.   [...]

[Biologie Moléculaire] Décision de replication de l'ADN

De plus, ce n'est pas parce qu'il existe des introns que les mutations n'affectent pas les séquences codantes. C'est juste que la pression de sélection est plus forte sur les régions codantes que sur les non codantes, et encore là il y a des nuances... Le moins de chances que ça affecte l'ADN codant est, tu conviendras, un non-sens.  [...] On a construit le plasmide suivant. ORIcolE1, gène conférant résistance à l'Amp, gène de sélection chez les Levures ( ura3 + ), en insert = fragment d'ADN génomique de S. cerevisiae. On a procédé à une transformation des cellules de S. cerevisiae [ura - ] par cette construction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteurs, gènes et plasmides

en fait jinsere un gene viral, dans un plasmide -. selection du bon plasmide dans des cellules bacteriennes (a laide de la selection AB), mais l'expression final du gene que je recherche doit se faire dans des cellules animales.  [...] dc bien que jai une petite etape de selection dans des cellules bacteriennes (liee au fait que mon plasmide a une resistance AB), mon promoteur doit etre eucaryote.  [...]