• Forum - Plasmide, Transformation, Souche

[Biologie Moléculaire] E coli et plasmide

Voilà on est parti d'une souche de Pseudo aeruginosa ou l'on veut intégrer un gène de cette souche dans un plasmide, puis faire une transformation dans e coli.  [...] Plus sérieusement on sait sérogrouper ses différentes souches depuis les années 1950's. Son génome a été entièrement séquencé en 1997. C'est une bactérie facile à cultiver aussi, quasiment domestique. Elle a été promue modèle bactérien dans les années 1940's et a notamment servi à comprendre les cycles des phages dans leurs généralités.  [...]

[Microbiologie] Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

J'aurais besoin de rendre des cellules E.coli compétentes pour faire une transformation de plasmide mais je n'ai dans mes stock que la souche ATCC Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers (n° 8739).  [...] Pour le coup, je cherche juste à identifier un plasmide de résistance donc j'ai juste besoin d'une souche qui transforme bien et qui soit high copy.  [...]

[Génétique] Manipulation génétique chez procaryote

Le plasmide pL31 est introduit par transformation dans la souche L4 qui contient une mutation conditionnelle dnaAts(thermosensible). La souche L4/pL31 est cultivée a 30°C dans un milieu riche sans ampicilline, pendant 6 heures.puis une partie de la culture est transfere à 42°C,pendant 16h,l'autre partie etant maintenue à 30°C.  [...] transformation par recombinaison homologue en quoi la recombinaison homologue a un lien avec la transformation surtout chez les bactéries. Non ton plasmide se multiplie grace a une origine de réplication.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

N'ayant pas de marqueur de sélection pour mes plasmides recombinants, je dois m'assurer d'une bonne linéarisation et déphosphorylation de mon plasmide pour éviter d'avoir des plasmides natifs. Donc, pour m'assurer dans un premier temps de la bonne linéarisation, je transforme avec le plasmide linéarisé.  [...] Si tu fais une transformation avec 100ng de plasmide tu peux avoir beaucoup de transformants. Alors si tu peux 1micro gramme de plasmide que tu digères, s'il reste même moins de 10% de plasmide non digéré tu vas avoir des soucis lors de ta transfo.  [...]

[Microbiologie] Plasmides incompatibles?

) qu'a partir du moment qu'on arrive a faire la transformation, qu'on maintient le plasmide avec des antibio, et qu'il n'est pas incompatible avec des plasmides eventuellement deja present dans les souches naturelles, il n'y a aucun probleme.  [...] Je suis contre ce qu'elle dit, car je crois (mais dites moi si c'est faux.) qu'a partir du moment qu'on arrive a faire la transformation, qu'on maintient le plasmide avec des antibio, et qu'il n'est pas incompatible avec des plasmides eventuellement deja present dans les souches naturelles, il n'y a aucun probleme.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Lors d'une transformation transitoire, est ce que les histones se lient a l'ADN du vecteur pour former des nucléosomes ou la petite taille du plasmide empêche justement les nucléosomes de se former Observera-t'on une différence entre un plasmide eucaryote et un plasmide bactérien au niveau de ces nucléosomes.  [...] J'utilise des HEK-293 et mes conditions de transformations pour cette souche sont optimales (~ 90% de cellules transformées). J'ai déjà transformée cette lignée avec d'autres plasmides qui ont bien exprimés leur gène donc je doute que ça soit la transformation qui pose problème.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Mon controle positif lors de la transformation est le plasmide contenant l'insert (non digéré) c'est ce plasmide que j'ai digéré pour isoler l'insert.  [...] Ce n'est pas mon cas car mon controle de transformation est justement le plasmide contenant l'insert (fournit par le collaborareur qui est celui qui a été digéré et purifié sur gel) et les bacteries pousse.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

J'ai transformé des bactéries DH5alpha avec mon plasmide GST et mon plasmide GST-prot d'intérêt. Pour chaque transformation j'ai effectué un contrôle non induit. J'ai testé deux stragégies d'induction avec 1 mM IPTG. 2h à 37°C ou toute la nuit à 30°C.  [...] De la même manière j'ai co-migré un extrait protéique obtenu après transformation des bactéries avec un pGEX vide et là aussi la colonne reste entièrement vide. Ces contrôles signifient bien que mon anticorps ne marque pas une protéine bactérienne endogène ou un bidule provoqué par l'insertion du seul plasmide.  [...]

méthode de transformation d'une cellule souche

J'ai presque fini un de mes exposé sur le cellule souche il ne me reste qu'a savoir comment les scientifique compte pour crée des organe a partir d'une dellule souche. selon ce que je me suis fait dire par un site (pas toujour fiable) c'est que personne na réussi encore mais meme si c'est imppossible je voudrais savoir qu'est ce qu'il on aisseiller (la methode utilisé).  [...] En effet ce n'est pas encore demain que l'on obtiendra un organe à partir de cellules souches, mais les recherches sont en cours.  [...]

[Biologie Moléculaire] perte spontanée d'insert lors du clonage

- plasmide sensé avoir inseré mon fragment dans le bon sens (ce qui est en réalité après vérification par pcr et par digestion ne contenant pas du tout mon insert) = entre 10 et 20kb.  [...] -plasmide sensé avoir inseré mon fragment dans le bon sens et digéré avec sacI lors de la vérification = toujour entre 10 et 20kb mais un peu derrière du même plasmide non digéré (ceci est valable pour toutes les 4 clones).  [...]