• Forum - Plasmide, Résistance, AMP

[Biologie Moléculaire] Décision de replication de l'ADN

On a construit le plasmide suivant. ORIcolE1, gène conférant résistance à l'Amp, gène de sélection chez les Levures ( ura3 + ), en insert = fragment d'ADN génomique de S. cerevisiae. On a procédé à une transformation des cellules de S. cerevisiae [ura - ] par cette construction.  [...] Il y a deux cas possibles. soit le plasmide contient une origine de réplication reconnue par la machinerie de la Levure et dans ce cas on aura une prolifération des cellules l'ayant, soit le plasmide n'en contient pas et les cellules ne survivront pas.  [...]

[Génétique] Manipulation génétique chez procaryote

Une banque genomique de la souche sauvage (WT) E.Coli est prepare dans un plasmide pBR322 qui confere la resistance a l'ampiciline(Amp R). Les plasmides recombinants de la banque sont transforme dans la souche L3 de E.Coli dont le genotype est polA. Trois clones L3 Amp R sont ainsi selectionés.  [...] Est ce qu'on peut faire l'hypothèse que certains plasmides sont assez résistants pour rester 16h sans se répliquer, survivre, et de nouveau à 30°C recommencer à se répliquer.  [...]

Plasmide recombinant

En fait, dans le plasmide, on place souvent un premier gene de resistance à un antibiotique dans la région de recombinaison. Ceci pour pouvoir selectionner les vecteurs recombinants. Faciel et instinctif je dirais.  [...] On selectionne deja sur la résistance les cellules portant le plasmide. On a donc dans le lot des cellules qui portent le plasmide et des cellules qui ont recombiné. Ce que l'on veut maintenant c'est n'avoir plus que les cellules qui ont recombinées. Du coup on va les tester avec le gène de sensibilité à l'antibiotique.  [...]

Les colonies satellites dans un milieu aditionné d'Ampicilline

Pour mieux m'expliquer. j'ai réalisée une transformation d'un plasmide (contenant 3 gènes de résistances, parmi eux l'ampicilline) avec un insert cloné sur le gène de résistance à l'ampicilline dans DH5alpha donc en principe ce gène devient non fonctionnel.  [...] Si tu veux sélectionner les bactéries sensibles à l'amp, tu dois procéder comme ça. (donc pour rappel, tu cherches les bactéries amp sensibles, antibio 2 resistantes, antiobio 3 resistantes cad a dire portant le plasmide ou la résistance a l amp est altérée par un insert (mais les deux autres restent effectives).  [...]

[Biologie Moléculaire] Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN

*Bref, le contexte est le suivant. on veut cloner un gène de l'ADN humain, pour ceci on utilise les plasmides des bactéries d'E.Coli qui contiennent entre autres des gènes de résistance à la tetracycline et l'ampicilline, grâce aux enzymes de restriction on peut incorporer le gène humain qu'on veut cloner dans le plasmide à un emplacement entre les séquences du gène qui code pour la résistance à la tetracycline.  [...] à mon avis, il reste encore une ambigüité dans ton énoncé. En fait, il s'agit d'un seul et unique plasmide qui porte les 2 gènes de résistance aux antibio. N'est-ce pas Effectivement ce point là n'est pas très clair.  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Pour savoir si les plasmides (dans la bactérie) ont l'insert, l'idée serait de sélectionner sur néomycine. Mais apparement la bactérie aurait déjà un gène de résistance à la néomycine, donc on ne saurait pas si c'est la bactérie ou le plasmide (avec insert) qui donne la résistance.  [...] C'est l'insert qui porte le gène de résistance à la néomycine. Donc, si j'ai des colonies sur LB+strepto+néo, c'est que mon plasmide est recombiné et est dans les bactéries.  [...]

[Microbiologie] Culture bactérienne troublante

j'ai une grande question qui a plus ou moins a voir, est ce que le plamide que l'on transfecte à la bactérie risque de tuer la bactérie, je m'explique, dans vos expérience il semble que la concentration de vos plasmide soit trop important mais ce peut il que le plasmide réagisse mal avec l'adn bactérien et soit léthal.  [...] ce peut il alors qu'en changeant de plasmide le résultat change et par conséquent si l'on effectue la transfection sur des bactéries des plasmides différents ayant tous les meme gene d'interret ( dans des expériences séparées sur la meme souche de bactérie) des résultats différents.  [...]

comment connaitre le nombre de cellule dans une colonie?

bonjour, je doit mettre en place un test de détection rapide de resistance a l AMP par betalactamase, grace a deux souche E. coli modifié. une une codant la GFP(KAN+) et l'autre la RFP (AMP+).  [...] pendant que toi tu encemence tes galeries... tu demande a un assistant de compter en direct ta suspension au microscope sur lame de malssez.   [...]

[Biologie Moléculaire] changement de gene de resistance dans pCDNA3

Je travaille actuellement avec le plasmide pCDNA3 qui contient le gene de resitance a l'ampicilline. La sequence de ce gene est reverse complement dans la sequence du plasmide. Je souhaite remplacer ce gene par le celui de resistance a la kanamycine. Q. Dois-je inserer la sequence reverse complement ou ca n'a pas d'importance.  [...] Beh, le gène de résistance à la Néomycine sert à sélectionner les transfectants stables dans les cellules de Mammifères... Non.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

Pour ce qui est finalement du choix du vecteur, il te faut un vecteur contenant une origine de réplication procaryote, un gène de résistance à un antibiotique et pourquoi pas le gène beta-galactosidase à cheval du polylinker (cela permet de sélectionner les bactéries qui ont un plasmide ayant intégré un insert), et bien sûr le polylinker.  [...] pBR322 est vraiment le vecteur de base. C'est je pense, le premier que l'on a du vous présenter. C'est un vecteur de clonage qui contient simplement. une ori de réplication, un gène de résistance (Amp r pour les procaryote, Tet r pour les eucaryotes), et une cassette de clonage.  [...]