• Forum - Plasmide, Protéine, Tag, Voie

[Biologie Moléculaire] Transfection et induction

Alors voilà, pour commencer j'envisage de faire des trasfections de HEK 293 par un plasmide codant une protéine parasitaire et conférant un tag HA afin de voir si elle active la voie NF-kB (gràce à un plasmide rapporteur et test luciférase).  [...] Pour être plus précise on m'avait conseillé aussi d'utiliser une protéine dont je sais qu'elle n'active pas cette voie, elle-même taggée HA. Malheureusement je n'en ai pas de disponible en ce moment. Mais d'après ce que tu me dis, ce n'est pas nécessaire. mon vecteur vide est un suffisament bon contrôle, c'est ça.  [...]

[Biologie Moléculaire] cDNA et TAG quelle relation?

et pour le plasmide pTTQ18 on dit que c'est un plasmide qui ne présente pas de cDNA,et pour ça on peut pas purifié le protéine recombinante qui en résulte par chromatographie d'affinité on utilisons le protéine de fusion issu de la traduction de la sequence TAG. est ce que c'est juste.  [...] - la seconde est une notion de biochimie. Un TAG comme par exemple le TAG histidine est une courte portion d'acides aminés permettant notamment de purifier une protéine produite par génie génétique. Dans ce cas, la séquence en ADN codant pour ce tag est insérée au début du gène d'intérêt dans un plasmide.  [...]

Pourquoi utiliser le vecteur pH6EX3 pour faire du clonage moléculaire?

Dans une séance de laboratoire, on a utilisé le vecteur pH6EX3 pour y insérer un gène qui code pour la protéine BIP, pour transférer tout ça dans des bactéries E.coli. Je me demandais pourquoi on a utilisé ce verteur et pas un autre.  [...] peut être parce que ce plasmide permet de tagger l'insert avec un 6His. En fait cela permet de produire une protéine de fusion constituée de la séquence codée par l'insert et du tag 6xHis, tag qui peut être utilisé ensuite pour de la purification sur colonnes style NiNta, pratique pour avoir un peptide pur (ou presque).  [...]

[Biochimie] Protocole IMAC

J'ai effectué une transfection d'un plasmide PcDNA 3 contenant un insert codant pour une protéine recombinante possédant un Tag His (6 fois)en N-Terminal, dans des cellules adhérentes HEK-293 (eucaryote).  [...] Par la suite je compte réaliser un dessalage pour éliminer l'imidazole du tampon d'élution. Puis, la protéine sera conservée dans du PBS à 4°C.  [...]

[Biotechnologie] Clonage et cancer

Ce que je ne saisis pas c'est en quoi l'amplification de ce gene permet d'étudier ce type de cancer. Des proteines humaines seront synthetisées dans la bactérie transformée, mais en quoi ce permet-il de progresser dans la compréhension des mécanismes carcinogenes.  [...] Là tout ce que vous faites c'est surproduire la protéine. J'imagine que votre plasmide porte un tag ([His] 6. GST. HA, FLAG...) pour pouvoir la purifier mais ensuite Vous étudiez sa structure Cherchez ses interactants.  [...]

[Biologie Moléculaire] purif des proteines recombinantes apres coupure au facteur X

Apres passage par la colonne Nickel pour récupérer la protéine recombinante (sachant que la chaperonne fait 50 Kd et ma proteine d'interet fait 25 Kd) comment dois-je procéder (après coupure au facteur X) pour récupérer le maximum de protéine et éliminer tous l'imidazole (l'imidazole est dangereux pour la suite de ma manip).  [...] la carte de mon plasmide est comme suit. une Chaperonne située en 5' (appelée Trigger factor. cela facilite le bon repliement de ma proteine d'interet et augmente d'une facon tres significative la solubilité de la proteine recombinante) suivi d'un His-tag puis du site de coupure du Facteur Xa et à la fin le Multiple cloning site.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR avec augmentation de la T°C d'hybridation?

Il me faut donc le tag hexa-His sur l'insert parce qu'ainsi la protéine sera produite avec. Je ne suis pas sûre de comprendre le pourquoi d'un tag hexa-His sur le plasmide, en fait.  [...] Séquencage obligatoire si tu as des zones à forts %CG. Les TAQ y perdent parfois peur petits et tu te retrouves avec une base en plus ou en moins. C'est pas trop grave pour un clonage pour faire une sonde. Mais pour l'expression de protéine c'est dramatique, tu peux te prendre un décalage de phase qui te pourri ton truc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent Clonage

Nous avons reçu un nouveau plasmide, je dois y faire exprimer une protéine. L'insert d'interet est exprimé dans un autre plasmide.  [...] La protéine que je veux exprimer doit avoir une GFP et un tag His, ces deux là sont déjà dans le nouveau plasmide, mai puisque je dois synthetiser mes amorces avec un codon stop, comment ces tags peuvent-ils etre lus.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

Voilà, j'ai un plasmide de 10Kb dans lequel je souhaite insérer 3 nucléotides à un endroit bien particulier pour créer un site de restriction. Une fois ce site de restriction présent j'insèrerai mon tag Flag. L'un des points limitant c'est que je souhaite insérer flag dans une boucle extracellulaire courte de ma protéine finale.  [...] ..bref, j'ai tout essayé, je vous raconte pas le temps que ça m'a pris. Les quelques bactéries rarements obtenues après transfo et action de la DpnI, ne poussaient pas ou très mal en milieu liquide, et quand miracle il y avait, elle contenait...que dalle. Contaminations résistantes à l'ampicilline (gène de résistance dans mon plasmide).  [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine étiquetée

C'est une protéine où on va lui coller une séquence Tag (exemple, l'histidine) et ça permet de savoir quel dose de protéines exogènes tu utilise dans ta culture cellulaire.  [...] Le tag est une séquence d'acides aminés rajoutés en amont ou en aval de ta protéine et permet de la visualiser (tags fluos) ou de la purifier (his tag, gst tag...).  [...]