• Forum - Plasmide, Protéine, Souche

[Biologie Moléculaire] Immunodétection après production d'une protéine recombinante

Lors d un TP nous avons transformé une souche E coli (rosetta) avec un plasmide recombinant afin de produire et purifier une proteine d interet. L expression du gene de cette proteine est sous la dependance du promoteur T7, et necessite ainsi l arn pol T7.  [...] Oui j ai fait un mauvais raccourci, je voulais dire que le gene etant apporté par un plasmide, il y en a donc plusieurs copies dans E Coli et une production plus importante de proteine lysozyme.  [...]

[Génétique] Experience temoin gene delete

Voila je travaille sur la fonction d'une proteine chez la levure. J'ai suivi la croissance de deux souches (sauvage et mutee*, la mutation correspondant a la deletion de la proteine etudiee) et observe une difference du taux de croissance. Bref.  [...] Pour me constituer un temoin, mon tuteur de stage m'a demande d'apporter via un plasmide le gene de la proteine etudiee dans la souche deletee (et donc normalement retablir le phenotype sauvage. Et ainsi s'assurer que la difference observee entre ces deux souches est bien due a la deletion de la proteine et non pas a un effet que pourrait avoir le fait d'enlever simplement le gene (pour exemple deregler un autre gene).  [...]

[Génétique] Conséquence de l'intégration d'un vecteur dans une bactérie

Oui c'est ça que je voulais qu'elle comprenne toute seule. si elle a plus de boulot à faire que les autres du TP elle mettra plus de temps -. la bactérie qui doit fabriquer le plasmide et synthétiser la protéine est ralentie dans sa multiplication.  [...] Seule exception. quand on transforme une souche avec un plasmide, il faut la laisser un moment (45 minutes il me semble) en milieu non sélectif, pour qu'elle ait le temps d'exprimer la protéine de résistance. Mais elle n'a alors pas le temps de se diviser et de perdre le plaqmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

Pour l'instant j'amplifie mon plasmide dans une souche de Coli DH5alpha. Instinctivement (après mes aventures dans le monde de la production en pET) j'allais passer sur une souche BL21 peu pratique à utiliser. Puis réflechissant un peu je me suis rendu compte que finalement la souche BL21 n'a surtout d'intérêt pour la production de protéines en pET que parce qu'elle permet l'utilisation du promoteur T7 du plasmide.  [...] Je n'ai jamais produit de proteine de fusion. J'avais besoin d'une construction et au lieu de recevoir un simple plasmide, j'ai recu une construction dans un pGEX. Je suppose que c'est pour produire ma prot en fusion avec les GST.  [...]

Virus = vivant ??? - Page 2

Simplement tout ces gènes sont groupé chez les alpha-protéobactérie sur un méga-plasmide ayant des caractéritiques atypique par rapport au génome cellulaire (taux de G+C de l'ADN plus faible pour le plasmide, usage du code génétique différent etc etc...). De plus la transformation in vitro de souches non-symbiotique en une souche symbiotique par ajout de ce méga-plasmides a été démontrée expérimentalement.  [...] Selon les conditions il peut exprimer les proteines necessaire a son cycle lytique (il va se repliquer a toute vitesse), ou au contraire reprimer ces genes et activer ceux charger de le mettre en dormance, alors le virus integre dans le chromosme attends des jours meilleurs pour se re-activer.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transfert de résistance

Si je prends une population de souches résistante, j'en ai à peut près la moitié qui présentent un plasmide a l'électrophorèse (après extraction avec un kit traditionnel). Et je veux savoir si la souche est capable de transférer son plasmide à une souche sensible et la rendre résistante.  [...] Je fais mon liquid mating, l'obtient des transconjugants résistants mais je ne retrouve pas forcément le plasmide... Premier problème. A ma connaissance, une bactérie ne peut transférer sa résistance que par le biais d'un plasmide, non Alors comment mes souches deviennent résistantes Estce qu'elle peuvent intégrer le plasmide aussi rapidement.  [...]

Problème de rendement kit Maxiprep

Tu as dit que tu utilisais une souche d'expression, pour peu que ton gène possède tout son CDS et qu'il y a un promoteur dans le plasmide, si la bactérie l'exprime correctement il se peut que cette protéine ait un effet,  [...] bien souvent quand ca arrive, on observe plutot un auto-empoisonnement et donc elles ne se reproduisent pas, donc vu que tes bactéries se développent il n'ya pas auto-empoisonnement, mais on sait jamais, si c'est une protéine qui joue sur la régulation des plasmides ou sur les séquences génétiques (sans toucher au chromosome et donc a la viabilité) peut etre que ta protéine est la cause.  [...]

[Génétique] Manipulation génétique chez procaryote

Une banque genomique de la souche sauvage (WT) E.Coli est prepare dans un plasmide pBR322 qui confere la resistance a l'ampiciline(Amp R). Les plasmides recombinants de la banque sont transforme dans la souche L3 de E.Coli dont le genotype est polA. Trois clones L3 Amp R sont ainsi selectionés.  [...] Le plasmide pL31 est introduit par transformation dans la souche L4 qui contient une mutation conditionnelle dnaAts(thermosensible). La souche L4/pL31 est cultivée a 30°C dans un milieu riche sans ampicilline, pendant 6 heures.puis une partie de la culture est transfere à 42°C,pendant 16h,l'autre partie etant maintenue à 30°C.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR colonie et PCR ADN

-La souche bactérienne est différente. En effet je travaillais sur des TOP10 avant, et là je suis sur BL21. Problème de BL21 par rapport à ce plasmide/insert.  [...] Quand tu dis que le plasmide est présent seul dans la miniprep, sais tu si il est sous forme linéaire ou circularisé par la ligation. (Une digestion avec une seule enzyme devrait donner 2 fragments si il est linéaire). Imaginons que la ligation ne fasse que circulariser le plasmide sans introduire l'insert, ça pourrait conférer la résistance et la PCR positive proviendrait de l'insert qui est transformé en même temps.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

Enfin a en croire la carte plasmidique, votre protéine serait sous le contrôle d'un promoteur tac je vous conseil cette littérature,. http.//www.sciencedirect.com/science...78111988904404 vous y trouverez des éléments de réponse.  [...] J'avais eu le même probléme l'année derniére, en plus moi je faisais des litres de culture, je ne te raconte pas la galére. Pour moi c'était. BL21 Star(DE3), plasmide pGEX-2T avec fusion GST-toxine bactérienne, promoteur tac et induction á l'IPTG. Finalement la solution dans mon cas pour avoir une assez bonne quantité de protéines recombinantes, était d'induire á une DO tardive de 1.  [...]