• Forum - Plasmide, Expression, Promoteur, ORF

[Biologie Moléculaire] Fournisseur plasmide d'expression (avec ORF spécifique)

Je recherche une boite qui pourrait me fournir (rapidement) un plasmide d'expression avec l'ORF de mon choix (de la même manière que l'on choisi des siRNA dans une banque).  [...] La question que l'on pose à l'aide de ce plasmide est urgente donc j'aimerai trouver le plus vite possible un plasmide d'expression AVEC PROMOTEUR et l'ORF d'intérêt. J'ai regardé chez Dharmacon, Invitrogen, Qiagen, Eurogentec et je n'ai rien trouvé.  [...]

[Biologie Moléculaire] ARN contaminé par de l'ADNgénomique

J'ai réalisé un traitement DNase de mes ARN lors de l'extraction ARN mais lorsque j'essaie d'amplifier mes ADNc avec des primers se trouvant dans le promoteur de mon plasmide ou à l'extérieur de mon ORF (après le teminateur et dans le promoteur), je sort toujours quelque chose, or je ne devrait pas puisque je recherche des ARNm (RT avec oligodT) qui, si mes souvenirs sont les bons, correspondent uniquement à l'ORF (ATG au STOP).  [...] Lorsque j'ai refait le test, j'ai testé en même temps sur des ARN DNasés, des ARN DNasés RNasés et des ARN non DNasés RNasés, voici les résultats de PCR sur ARN avec des primers toujours dans le promoteur.  [...]

unité de transcription complexe eucaryote..

Ceci dit, au cours de ce fil, j'ai comme l'impression qu'il y a une belle confusion entre ORF et le gène. Car ce dernier est bien composé du signal de fin de transcription, du promoteur minimum, de l'ORF ainsi que de séquence cis-régulatrices. Par contre l'ORF (qui lui seul code pour le produit final du gène), lui, est borné par le codon initiateur et un codon stop et ne contient pas le signal de fin de transcription.  [...] Oui mais si cet ensemble (qui part d'un promoteur et qui va jusqu'à un signal de fin de transcription) contient en réalité l'information de 2 gènes,c'est à dire si je en me trompe pas. ORF du 1er gène, ORF du 2ème gène et des séquences cis-regulatrices (=introns), et que manifestement l'ARNpol ne permet pas de distinguer les 2 ORF, comment ces derniers sont-ils distingués lors de la traduction.  [...]

recherche d'opéron dans une séquence nucléotidique

je cherche des logiciels de bioinformatique qui me permettent de chercher les opérons, les promoteurs ainsi que les séquences 5' et 3' UTR dans une séquence nucléotidique chez les procaryotes.  [...] Pour rechercher un operon, le plus simple est de le faire avec des outils bioinfo disponible sur le net inbiogen. Tu recherches les differents ORF de ta sequence, si des ORF sont trés proches tu recherches en amont de chacune un promoteur... et tu auras tes eventuels operons (1 promoteur pour 2 à 5 genes).  [...]

[biologie moléculaire] Numérotation d'un plasmide

Quant à la position du gène de résistance, il faut veiller à ce qu'il soit pas trop près de la MCS, suffisament loin du gène rapporteur s'il y en a un- pour éviter que le gène de résistance soit exprimé à partir du promoteur qui précède la MCS- et qu'il y ait un terminateur après pour que les transcrits du gène de résistance n'altèrent pas la réplication.  [...] Les genes de resistance sont sous le controle de quel type de promoteur tu peux me donner un exemple parceque souvent sur une carte de plasmide le promoteur du gène de resistance n'est pas placé du coup parfois même je me demande comment sa marche.  [...]

plasmide pDONR/Zeo

En introduisant un plasmide codant la recombinase spécifique, on peut remplacer le gène par le marqueur de résistance (CmR). Le gène se trouve quant à lui inséré dans le vecteur.  [...] Quant à ccdB, il code une protéine poison et, comme CmR, est un marqueur de sélection positive. si ton gène est bien inséré dans le plasmide, au bon endroit et tout, ccdB ne sera plus fonctionnel et en principe seul les clones recombinants (= portent les plasmides ayant incorporé un gène) sont viables.  [...]

Comment orienter un fragment d'adn dans un vecteur

On veut introduire ce fragment dans un vecteur contenant lui un promoteur, mais pour cela il faut le mettre dans le bon sens pour que l'ORF soit dans le bon sens par rapport au promoteur.  [...] L'utilisation de sites de restriction est le seul moyen pour faire cela. Une autre solution est de ne pas orienter le fragment, et une fois le clonage fait tester les plasmides pour trouver ceux qui auront un insert dans le bon sens. Apres tout tu as 50% de chance que ton insert soit dans la bonne orientation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ajout de sites de restrictions

En faisant comme cela, vous allez récupérer votre ORF borné par les sites de restriction. Vous n'aurez plus qu'à digérer et cloner directement dans votre plasmide d'intérêt.  [...] The pGEM®-T Vector Systems are convenient systems to clone PCR products. The pGEM®-T Vector is prepared by cutting the pGEM®-5Zf(+) Vector with EcoRV and adding a 3' terminal thymidine to both ends. These single 3'-T overhangs at the insertion site greatly improve the efficiency of ligation of a PCR product into the plasmid by preventing recircularization of the vector and providing a compatible overhang for ligation of PCR products generated by thermostable polymerases that add a single deoxyadenosine, in a template-independent fashion, to the 3'-ends of amplified fragments. (site promega).  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage en phase

Sinon, le clonage est très simple à comprendre, sur la papier. Votre orf doit entrer dans la même phase de lecture qu'une autre orf sur le plasmide. Il suffit de compter le nombre de nuclotides entre la fin de la première orf et l'entrée de l'insert. il faut que ce soit un multiple de trois.  [...] Je suis désolé mais je ne comprends pas très bien, est ce possible de m'expliquer sur cet exemple je ne comprends pas comment voir si on est bien phase.   [...]

[Biologie Moléculaire] cistron

Bonjour, Un cistron est un synonyme désuet pour gène. Un cistron est une région du génome qui ne porte qu'une seule information génétique transcrite en ARN.   [...] On utilise aussi le terme polycistronique pour nommer certains gènes bactériens. Ici, il y a un promoteur qui permet de transcrire plusieurs ORF consécutifs en un seul transcrit. On parle aussi d'opéron polycistronique.  [...]