• Forum - Plasmide, Contrôle

[Biologie Cellulaire] probleme de transfection

Normalement je devais cotransfecter dans une lignée cellulaire un plasmide avec le promoteur qu'on étudie et qui contrôle l'Expression de la luciferase, et le plasmide controle codant pour la beta-Gal.  [...] Problème. une fois la transfection finit (seulement 5-10 minutes aprés), je m'aperçois que la personne qui a écrit les concentrations de plasmides a fait une erreur. Donc mon plasmide control est 10 fois moins concentré…du coup dans la panique (il me faut absolument réussir cette transfection) j'ai procédé a une autre transfection sur les mêmes cellules avec le plasmide contrôle pour essayer de complémenter (dans les 30 minutes après la première transfection)…je sais c'est stupide. Mais quand on panique….  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de construction d'une banque d'ADNc

Est-ce que vous rajoutez bien la BSA qui est nécessaire pour un clivage optimal par Sfi1 Quel contrôles intra-manip avec vous fait (contrôle de clivage par l'enzyme, de recircularisation du vecteur,...) Quelles bactéries utilisez-vous pour la transformation Avez-vous fait le contrôle de base nécessaire sur la transformation des bactéries. transformation avec un plasmide contrôle.  [...] J'ai utilisé les bactéries electro et thermocompétentes et je les ai vérifié (la compétence) par des plasmides tests... elles sont compétentes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Nous avons fait une clonage d'un ADNc dans un plasmide... En parallèle, nous avons fait un contrôle négatif qui contenait le vecteur mais sans insert (l'insert étant remplacé par de l'eau distillée). J'aimerais savoir à quoi sert exactement le contrôle négatif.  [...] Sinon le sens du contrôle négatif (je ne suis pas certain que cela ait été dit clairement) est d'évaluer indirectement la qualité de la coupure du plasmide. Si après vos restrictions il vous reste du plasmide non coupé, il va transformer. Ce qui est intéressant dans ce contrôle c'est de le comparer à votre boite expérimentale.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

1 contrôle de transformation, avec une dizaine de picogrammes de pUC18 ou équivalent pour des bactos électrocompétentes qui sont attendues à une efficacité de 10^8 colonies par ug de plasmide.  [...] Normalement dans le kit tu devrais avoir un plasmide controle a transformer. Il faut vraiment que tu verifies tes cellules, ca arrive tres souvent.  [...]

transformation e.coli par le plasmide pglo

Tu fais ta transfo (tu la fait bien biensur sinon ça risque pas de marcher) puis tu incube overnight. Et le lendemain tu compte le nombre de colonie positives en fonction de ta selection puis tu calcul la quantité de plasmide que tu a utilisé pour la transfo.  [...] Là tu es donc à 0.05µg/µl (puisque j'ai considéré que tes 400µg d'eau stérile c'est enfaite 400µl d'eau stérile LOL) Et donc si ta fait la transfo classique 10µl plasmide + 40µl cellules alors ta étalé 0.5µg de plasmide. Donc si t'a compté 600 colonies admettons, alors l'efficacité c'est.  [...]

[Biologie Moléculaire] perte spontanée d'insert lors du clonage

Je refait le manip (dépuis le pcr des colonies positifs, avec comme controle le plasmide vide) pour confirmer que je me suis pas trompé de colonies mais ça donne toujours la même chose. Donc je commence à penser que les bactéries rejettes mon insert et seulement quand celui-ci est dans le sens que je veux.  [...] Oui à chaque fois que je fait le criblage, je fait toujours un contrôle négatif plasmide seul et qui me donne aucune bande (comme j'utilise un amorce dans le plasmide et un autre dans mon insert).  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Mon controle positif lors de la transformation est le plasmide contenant l'insert (non digéré) c'est ce plasmide que j'ai digéré pour isoler l'insert.  [...] Ce n'est pas mon cas car mon controle de transformation est justement le plasmide contenant l'insert (fournit par le collaborareur qui est celui qui a été digéré et purifié sur gel) et les bacteries pousse.  [...]

[Microbiologie] Culture bactérienne troublante

Les deux ont intégré le plasmide correctement. Une transfection avec un plasmide controle a été réalisé. La culture bactérienne (LB+Amp) s'est faite a 37°C sur plateau shaker.  [...] La seule différence entre les plasmides ayant un même gène d'intérêt devrait être l'efficacité de transfection. Comme tu dois toujours avoir un contrôle de transfection qui ne dépend pas de tes expériences et qui te sert à relativiser, cela n'affecte pas tes résultats.  [...]

clonages

j'ai quelques questions techniques à propos des clonages. Lorsque l'on utilise 2 enzymes de restriction qui nécessitent la digestion sequentielle du vecteur, j'imagine que vous précipitez le plasmide entre les deux digestions enzymatiques Purifiez vous l'insert avant la ligation avec le plasmide Moi je ne purifie pas parce que je trouve qu'une gel extraction ou une précipitation fait perdre bcp d'insert, surtout que je précipite déja entre les deux digestions enzymatiques.  [...] 50-10 ng c'est bien, mais le point crucial est souvent la qualite des bacteries competentes qui varie beaucoup et peut etre testee avec un plasmide controle. Electrocompetentes,, c'est le mieux. Si tu les faits toi meme, resuspend les tres concentree a la fin.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de clonage avec pT7Blue

Si j'ai bien compris le TP (en anglais...) vuque le test positif n'a pas marché avec pT7Blue plasmide, on a donc utiliser pBluescript, mais je n'en suis pas sure... En cas de controle positif du kit commercial negatif, il faut donc changer le vecteur A quoi peut etre dut cet echec.  [...] le controle positif fut fait au debut du TP... mais il ne marcha pas avec le plasmide pT7Blue, quelles sont les raisons possibles.  [...]