• Forum - Migration, Transfert, Protéine

QCM - Immunoprécipitation

C-Après migration en SDS-PAGE et transfert sur nitrocellulose, on identifie la protéine B dans les complexes retenus par l'anticorps anti-protéine A au poids moléculaire de 5kDa.  [...] D-Après migration en SDS-PAGE et transfert sur nitrocellulose, on identifie la protéine C dans les complexes retenus par l'anticorps anti-protéine A.  [...]

[Biochimie] Western blot en pointillés

Tout se transfère très bien, sans augmentation notable de la température (avantage du transfert sans SDS), et les protéines de bas poids moléculaire (20 kDa), se transfère aussi bien. Tu peux donc essayer d'allonger le temps de transfert, voire de faire un faible voltage sur la nuit à 4°C.  [...] Le gel moins dense peut avoir un effet soit sur la migration, soit sur le transfert, ou les deux bien sûr (qui a dit que le transfert était à exclure des causes possibles du problème ). Les interactions de la protéine avec le polyacrylamide ne sont pas à exclure non plus.  [...]

[Biochimie] Problème avec mon western

J'ai un souci avec mon western blot sur SDS-Page, la migration et le transfert se sont bien déroulés, la première révélation de ma protéine d'intérêt s'était nickel.  [...] ...Dans le cas où les deux protéines ont des poids moléculaires suffisamment espacés, on peut couper la membrane entre les deux tailles attendues (grâce au marqueur de taille) et faire l'incubation de chacune des parties avec l'anticorps adéquat. Ou alors, si les deux protéines ont des tailles proches, il y a trop de risque de couper des bandes d'intérêt, donc on peut faire migrer deux gels en parallèle.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot / proteine hrp

A priori si tu es non dénaturant tu dois conserver la structure et la fonction de la péroxydase donc j'aurai tendance à dire que c'est possible tout en sachant que la migration et le transfert vont certainement quand même abimer ta protéine. Il faut essayer... tu me tiens au courant.  [...] Je voudrais faire la même manip que toi. Quelle est la composition de ton tampon de transfert Tu as transféré tes protéines sur membrane avec le système Biorad.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

J'ai déjà testé de nombreux protocoles sans succès (méthodes d'extraction différentes, migration sur petit/grand gel, transfert liquide/semi-sec..), donc j'aimerais savoir si quelqu'un possède un protocole précis ou des indications.  [...] Et, ATM est une grosse protéine, très peu abondante. Y a t-il une méthode d'extraction à privilégier de migration et de transfert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins

Ton protocol m'abeaucoup aidé. J'ai extrait mes proteines et fais mon dosage de Bradford. Par contre, jai un soucis, mes proteines sont très concentrées. Du coup, pour avoir les 20µg qu'il faut pour le gel, j'ai des valeurs negatives. Que faire dans ces conditions Estce que je peux diluer mes ech Et si oui, comment pourrais-je les quantifier a la fin.  [...] Encore une. Que se passe t-il lorsqu'on load des concentrations élevées de protéines Est-ce que. la migration, le transfert et la révelation se font quand même Ou bien la concentration de protéine est-elle très importante dans les puits.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Oui c'est ça je mets 3 membranes les unes sur les autres...et là j'ai des bandes bleues sur les 3 (les bandes de fin de migration) mais qd je les mets dans le rouge pinceau je vois aucune bande donc pas de transfert de protéine Ou un over transfert.  [...] Est il possible que je vois les bandes bleues (car bandes de fin de migration grosse concentration de bleu de commassie...je sais pas...) mais que les protéines n'ont pas transférées.  [...]

Immunoblot

Entre la migration sur gel et l'autoradiographie tu as en plus une étape d'électro-transfert qui comme son nom l'indique permet simplement de transférer les protéines du gel vers une membrane (que tu vas ensuite utiliser pour faire l'autoradiographie), encore une fois grace à un champ électrique (car le sprotéine sont toujours chargées négativement).  [...] Le western blot consiste en une migration des protéines dénaturées au beta mercaptoethanol et SDS dans un gel de polyacrylamide+SDS (détergent qui va dénaturer les protéines et les charger), un transfert sur membrane et une révélation grâce à des anticorps marqués.  [...]

Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

Il serait bon pour toi de revoir tes cours de biochimie. Où as-tu vu qu'une sérine pouvait adopter une conformation particulière Dans une protéine, une séquence peut adopter une conformation mais pas un acide aminé seul. D'autre part, seule la phosphorylation de la sérine pourrait diminuer la migration de la protéine car un groupement phosphate est encombrant.  [...] Il ne devrait pas y avoir de renaturation de la protéine durant la migration puisque normalement noirdez a coulé des gels contenant du SDS pour migrer en condition dénaturante, et le tampon de migration contient une quantité élevée de SDS. La seule renaturation qui peut avoir lieu est, a priori, durant le transfert car on dissocie le SDS de la protéine.  [...]

[Biochimie] Extraction protéique au laemmli ?

J'ai une petite question sur une manip que je fais en ce moment. J'étudie une protéine sur laquelle j'ai fait quelques délétions pour caractériser un peu mieux ces fonctions. J'ai transfecté les plasmides dans des HeLa, extraction des protéines au RIPA, migration et WB.  [...] Afin de voir si elle était exprimé, j'ai regardé en immunofluorescence, et j'ai un signal pour cette protéine. Donc elle est bien exprimé dans mes cellules. Par contre, la localisation de la protéine change et se retrouve dans des structures nucléaires (genre aggrégats).  [...]