• Forum - Méthode, Post, Fixation, Acétone

[Divers] Coupe au cryostat qui ne colle plus aux lames

Lorsque je veux utiliser mes coupes pour mes immunomarquages, je les sors du -20°C et les laisse revenir à température ambiante. Je réalise alors une post fixation avec du PFA 4% pendant 10 à 20min. Toutefois, quand j'enlève la solution de PFA pour faire un rinçage avec du PBS, toutes mes coupes partent de la lame et je ne peux pas réaliser mes traitements suivant (saturation, marquages avec Ac primaire puis secondaire, DAPI et montage).  [...] -Est ce que je dois changer de méthode de post fixation Acétone pendant 2 min par exemple ou un autre fixateur.  [...]

[Biologie Cellulaire] /[biochimie] demande de conseils pour la fixation de cellules

Mon problème est que je n'ai pas de marquage spécifique ni en fixation PFA ni en fixation méthanol. J'ai tenté de faire des perméabilisations TritonX100 0,1% ou 2%. ou SDS 0,1% ou 0,5% ( sur chaque mode de fixation)...rien mis à part un bruit de fond faible sur l'ensemble des cellules.  [...] Je viens de tomber dans la littérature sur un papier dans lequel ils observent la même protéine que moi. Ils le font sur des coupes de tissus en cryostat, fixées en éthanol 100% 4°C 30min puis acétone -20°C 3min puis ils font sécher la coupe et la réhydrate avec du PBS. Enfin ils perméabilise en TX100 0,2%.  [...]

Immunohisto

Il y a des méthodes alternatives, avec des dissolvants qui acceptent et des traces d'eau et qui dissolvent la paraffine. Méthode à l'acétone, au trichloréthylène par exemple.  [...] Sinon la fixation à la PFA est un abus de langage. La PFA c'est la poudre. On parle de solution PFA 2%, 4%... Mais en fait la PFA en solution forme tout bêtement du formol. Donc la fixation à la PFA est une fixation au formol.  [...]

Vocabulaire (fixation)

Mais ce qui est sûr, c'est qu'on nous a toujours dit 2 techniques de fixation au départ, que ce soit à la fac ou au lycée. la chaleur ou l'éthanol. Je peux pas en être plus sûr, pour avoir fait 2 ans en Bac STL et un stage de 1 mois en labo de microbio. De toute façon, ce sont toutes des techniques de fixation par déshydratation, peu importe la façon dont on déshydrate.  [...] L'important c'est de déshydrater. On peut donc très bien imaginer que la fixation se fasse avec de l'acétone (un peu violent peut-être), de l'éther anhydre, ou n'importe quel autre solvant organique très volatile. Faut être un peu chimiste parfois.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème avec gel d'acrylamide avec urée

L'expérience que je fais est la fixation d'ARN sur des billes de streptavidin-agarose. J'incube les billes avec des extraits nucléaires, je lave et j'élue les protéines avec un mélange d'acide acétique glacial 66% et 33mM MgCl2. Je précipite ensuite les protéines dans l'acétone (5 volumes) en présence de glycogène.  [...] Comme vous le voyez, il y a un énorme problème de migration pour les pistes 2 et 3, alors qu'il n'y a aucun problème pour l'extrait nucléaire repris dans du laemmli... J'en déduit que le problème ne vient pas de la migration ni du gel.   [...]

HPLC sur des protéines déjà dénaturées

J'ai déjà réalisé un test de densité (fixation de toute les protéines à une densité connue, puis on compte les protéines fluorescentes).  [...] Je n'utilise pas de SDS car on fait de la MS derrière et cela peut être galère, mais je me méfierais tout de même. L'interaction protéine/SDS est tout de même assez forte. Je ne suis pas sûr que tu l'élimines totalement par simple lavage/dialyse. Il me semble que la méthode standard pour éliminer le SDS est de faire précipiter la protéine dans l'acetone.  [...]

[Biochimie] L'acétone à froid dans l'extraction de l'ARN

Oui effectivement je confirme que l'utilisation de l'acétone est fait pour la précipitation des protéines, c'est vraie qu'on utilise généralement l'éthanol pour la précipitation des protéines, maintenant la précipitation à l'acétone est aussi plus efficace car, contrairement à l'éthanol, très peu de protéines sont solubles dans l'acétone.  [...] On me l'avait expliqué comme étant une étape de purification, toutes les molécules qui pouvaient se fixer sur l'acide nucléique ne pouvait le faire dans l'acétone. Sur le moment, j'avais pris ça pour argent comptant, mais maintenant, c'est vrai que c'est intéressant comme réflexion.  [...]

[Biochimie] Western blot sur Fractions polysomales

J'ai utilisé différentes méthodes. une extraction au méthanol mais ma révélation d'anticorps n'est vraiment pas jolie du tout, j'ai essayé une extraction au phénol/chlo,même résultat. Je suis passé à une extraction au TCA avec lavage à l'acétone et ici, ma membrane est moins sale, mais mes bandes ne sont pas encore satisfaisantes.  [...] Bonsoir, voici une méthode qui permet de séparer les acides nucléiques des protéines, et qui devrait donc fonctionner sur tes fractions. Cependant je ne l'ai jamais tester sur des polysomes.  [...]

[Biochimie] svp je veux la correction de ce tp

L'une des méthodes de dosage de l'activité polyphénol oxydase consiste à suivre au spectrophotomètre l'apparition des produits colorés.  [...] Précipiter les protéines par addition d'acétone glacée (3 vol d'acétone pour 2 vol d'extrait). Agiter 2 minutes et laisser 1 h à 4°C.  [...]

TP extraction des pigments végétaux : besoin d'aide !

Je suis étudiant et je dois faire un compte-rendu de TP sur les pigments assimilateurs des végétaux (extraction, purification, séparation).   [...] N'ayant pas utilisé le même mode opératoire que toi (pour ma part. séparation de pigments végétaux sur micro-colonne chromatographique), je dirais sans certitudes que l'acétone permet de ne pas retenir l'eau dans les fibres du papier filtre, vu que l'eau est néfaste pour la qualitée d'une chromatographie.  [...]