• Forum - Méthode, Clones, Séquence, Intérêt

[Biochimie] Question sur la biotechnologie

Le criblage te permet de retrouver ta séquence d'intérêt dans une banque. En effet une banque est très vaste (environ 3000 clones pour couvrir le génome de E. coli et presque 100 000 pour couvrir le génome de D. melanogaster ) donc on a besoin d'une méthode qui identifie en une seule fois le ou les clones qui portent la séquence d'intérêt.  [...] Mais... si ces milliers de clones dérivent tous du même gène, on aura juste ce fragment de gène en milliers d'exemplaires, non pas tous les gènes. A moins d'avoir des milliers de clones différents, et ceux en plusieurs exemplaires pour pouvoir réaliser la méthode de séquençage de Sanger (nécessité de pleins de clones identiques) pour pouvoir reconstituer les séquences au nucléotide près. Est-ce exact.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment extraire un gène??

On a un gène d'intérêt de séquence inconnue, on veut le transférer dans une cellule bactérienne ou végétale. Comment faire pour l'extraire et quelle enzyme de restriction choisir si on doit le cloner dans un vecteur type pGEM-T vector.  [...] Ca depend de l'interet que l'on a pour le gène considéré. Mais la méthode la plus classique est de faire une banque d'ANDg et de chercher les clones exprimant le phénotype que l'on cherche.  [...]

[Biologie Cellulaire] A quoi sert le co-transfert avec un vecteur de résistance à un antibiotique

La meilleure méthode est quand même d'avoir un gène de résistance dans le plasmide où tu as ton gène d'intérêt, ça te permet de minimiser le nombre de clones faux-positifs (uniquement résistant et sans gène d'intérêt).  [...] J'ai pas trop compris IngDr où tu n'étais pas d'accord... Si tu utilises deux plasmides (1 résistance et 1 gène d'intérêt), si tu n'as pas de bol. des cellules peuvent avoir la résistance sans le gène d'intérêt (et là, tu vas galérer pour trouver des clones stables.  [...]

[Biologie Moléculaire] Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN

*Bref, le contexte est le suivant. on veut cloner un gène de l'ADN humain, pour ceci on utilise les plasmides des bactéries d'E.Coli qui contiennent entre autres des gènes de résistance à la tetracycline et l'ampicilline, grâce aux enzymes de restriction on peut incorporer le gène humain qu'on veut cloner dans le plasmide à un emplacement entre les séquences du gène qui code pour la résistance à la tetracycline.  [...] Reste à repérer les clones en question sur la première boîte et à les amplifier, avant de vérifier qu'on a bien le gène d'intérêt dans le plasmide (par un coup de séquence par exemple...).  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

La méthode que Delirium m'a gentiement indiqué permet directement une sélection spécifique de l'Adnc avant clonage puisqu'on utilise des amorces spécifiques lors de l'amplification mais la sélection des clones d'intérêt au sein d'une banque d'adn na se fait-elle pas ensuite (une fois la banque construite) par criblage (hybridation avec une sonde specifique) où bien quel est l'intérêt de la banque.  [...] Une banque d'ADNc correspond aux clonages de tous les ADNc obtenus dans un vecteur. Cette banque est alors utilisée dans un crible afin d'identifier le clone possédant le(s) gene(s) recherché(s). Une fois les clones identifiés, il s'agit de preparer les plasmides et de les sequencer afin de caracteriser le fragment cloné.  [...]

Cartographie génétique

La cartographie physique permet de déterminer la séquence complète du chromosome et la distance entre le gène et les marqueurs en Pb, et c'est là que je ne comprends pas grand chose, on m'explique dans mon cours que pour réaliser cette technique, on utilise un génôme que l'on fragmente en fragments de grande taille, on les insère dans des vecteurs (chr artificile de bactérie par exemple), on insère ces vecteurs dans les bactéries, puis on compare les séquences des clones en repérant les points communs entre ces séquences et par recoupement on trouve la séquence.  [...] .. bref vous avez surement compris en me lisant que la méthode pour faire une cartographie physique est vraiment très floue, je ne comprends pas pourquoi on doit mettre des séquences dans des bactéries pour les comparer, ni même ce qu'ils appellent un clone (grands/petits clones).  [...]

[Microbiologie] évaluer la diversité

La composition de l'échantillon a été analysée par culture (des dilutions étalées sur un milieu solide et cultivée en anaérobie, 96 isolat identifies par séquençage du 16S) et par la méthode moléculaire (PCR 16S sur l'ADN total, clonage, séquençage de l'insert pour 96 clones).  [...] J'ai identifié 21 espèces au total, certaines par les deux techniques, d'autres seulement par culture ou par la méthode moléculaire. Le nombre d'isolats ou de clones pour une espèce varie de 19 à 1 (moyenne=9.4).  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteur banque BAC

Tout dépend de la longueur de promoteur que tu veux mettre en amont du gène rapporteur. S'il n'est pas très long, tu peux réaliser une PCR avec des amorces encadrant la région promotrice que tu désires. En 5' des amorces tu ajoutes la (les) séquence(s) de restriction correspondant au(x) site(s) de restriction que tu as choisi sur ton vecteur pour l'intégration du promoteur.  [...] Pour cela comment cela fonctionne et comment puis je être sur que les clones contiennent ma séquence promotrice complète.  [...]

[Biochimie] Purification post PCR

j'aurais voulu connaitre une methode qui, à l'issue d'une PCR avec TAq permet de purifier les amplifiats obtenus en écartant ceux qui possèderaient d'éventuelles erreurs.  [...] Après, si tu clones ce fragment dans un plasmide, il faudra amplifier individuellement des clones après transformation et vérifier ta séquence par séquençage.  [...]

[biologie moleculaire] Cartographie du genome

dans la catographie physique du genome humain je ne comprend pas comment les clones s ordonnent le long du chromosome et comment peut on grace a cela connaitre la sequence exacte est ce qu on doit faire un sequencage avant c pas clair dutout merci pour votre aide.  [...] Pour realiser une cartographie physique on sequence les différents clones, ces clones possèdent des fragments du chromosome a cartographier et ses fragments sont chevauchant (car digestion partielle par des enzymes de restrictions) donc les sequences des différents fragment sont ensuite alignées par ordinateur grace aux sequences chevauchante.  [...]