• Forum - IP, ADN, ARN, Cellule

[Microbiologie] ChIP & RNA-IP

Je cherche à faire un ChIP & un RNA IP pour regarder l'interaction entre un effecteur bactérien et l'ADN et l'ARN de la cellule hôte eucaryote.  [...] Tu veux faire quoi exactement avec ton RIP Le protocole et les contrôles adéquat peuvent dépendre de l'objectif recherché.   [...]

[Biologie Cellulaire] Marquage à l'iodure de propidium pour suivi du cycle cellulaire

Si j'ai bien compris le principe de cette méthode, la perméabilisation des cellules entraîne la sortie des fragments d'ADN de 180 bp, ce qui fait que l'intensité de fluorescence des cellules en apoptose est inférieure à celle des autres cellules (puisque proportionnelle à la quantité d'ADN), d'où l'apparition d'un pic en subG1.  [...] Pour le marquage IP, comme tu l'as dit, les cellules en subG1 le sont surtout à cause d'une fuite des fragments d'ADN clivés hors de la cellule. Seulement, le clivage régulier de l'ADN internucléosomal est typique d'un processus apoptotique. Dans le cas des autres morts cellulaires, la dégradation de l'ADN peut intervenir plus tardivement dans le cas d'une mort cellulaire par autophagie et/ou est plus anarchique comme dans le cas d'une nécrose.  [...]

[Biochimie] Différence western blot / immunoprécipitation

Ce sont deux techniques qui n'ont absolument rien à voir. Le Western Blot consiste à révéler la présence d'une protéine sur une membrane grâce à des anticorp, tandis que l'immunoprécipitation consiste à isoler une protéine -éventuellement en complex avec d'autres protéines/RNA/ADN - à partir d'un lysat.  [...] Certes, on réalise parfois un Western Blot après une IP, mais ça n'est pas le corps de l'expérience. On peut faire plein d'autres choses après une IP. récupérer l'ARN lié par la protéine - on parle alors de RNA ImmunoPrécipitation ou l'ADN - et on parle alors de Chromatin ImmunoPrecipitation. par exemple.  [...]

[Biologie Cellulaire] Aide pour une animation...

Beh disons que je n'ai pas compris pourquoi il veut mettre en avant la surface cellulaire balayée avec un laser... Ce que je sais du FACS c'est que le laser excitera l'IP au niveau de l'ADN et c'est suite à ça qu'on détecte la fluorescence. Du coup, la façon de présenter ce qu'il veut faire m'a paru un peu confuse.  [...] Ce qui me paraît beaucoup plus important c'est comment on classe les cellules en fonction des différents paramètres, chose qui risque de se retrouver un peu diminuée en raison de l'importance de l'animation.  [...]

Interaction cellule/virus

J'aimerais verifier l'interation d'une glycoprotéine virale avec une protéine cellulaire. Pour cela j'incube le virus et la cellule, et je veux faire une IP suivit d'un western blot.  [...] si t'as l'ADNc du récepteur cell, tu peux transfecter une cellule qui ne l'as pas et étudier la fixation du virus sur ces cellules mais c'est indirect.  [...]

[Biologie Moléculaire] Marqueur spéficique apoptose

En IF, tu peux mettre en évidence l'apoptose en faisant un marquage anti-cytochrome C (point focaux sur cellule normale, marquage diffus sur tout le cytoplasme sur cellule en apoptose).  [...] Ben justement, c'est pour ça qu'on fait un double marquage. L'annexine-5 va marquer plus ou moins toutes les cellules mortes, et le deuxième marquage à l'iodure de propidium ne va marquer que les cellules en nécrose. Vu que l'IP est un intercalaire, il ne pourra marquer que les nécrosées, puisque l'ADN des cellules apoptotiques est dégradé.  [...]

[Biologie Cellulaire] Manip de co-IP??? what's wrong!!!

ce qui me contrarie c'est que je révèle cette enzyme aussi bien des culots d'IP d'intérêt que dans le contrôle négatif. J'ai refait la manip au moins 5 fois et c'est tj le même résultat. D'après vous, comment vous expliquez cela... sachant que mon lysat cellulaire totale est toujours traité par la benzonase (pour dégrader l'ADN).  [...] j'immunoprécipite et là je révèle la topo2 dans tous les culots d'IP même dans les cellules non transfectées V5 (je rappelle que l'Ac immunopricipitant et l'anti V5 qui tague ma protéine d'interêt). je suis resté bouche B, et je suis rentré chez moi pour dormir.  [...]

Visualisation d'une cellule apoptotique....

Mais, il va nous falloir visualiser quelles cellules sont en apoptose et quelles cellules ne le sont pas (nécrose,...). Cette visualisation ne poserait pas de problèmeparticulier si on se foutait du sort des cellules après la visualisation, mais le problème (j'y arrive enfin ), c'est que l'on doit maintenir nos cellules vivantes pour pouvoir les patcher (Patch-clamp).  [...] Sinon certaines cellules apoptotiques presentent un marquage IP intermediaire entre negative et positive, c'est aussi a tester. Il suffit de rajouter a ta culture de l'IP sans permeabilisant.  [...]

Triple hybride

Est ce que vous connaissez une technique qui permettrait de mettre en évidence une intéraction entre 3 protéines, elles même en intéraction avec de l'ADN Bien sûr sans passer par le double hybride...(sinon c'est trop facile ).  [...] le triple hybride c'est pour mettre en evidence des proteines interagissant avec un ARN non Je vois mal l'apport dans le cadre d'une etude d'interaction avec de l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot : quelle unité ?

Sinon, je suppose qu'ils font une IP anti-His pour ne regarder l'ubiquitination que de leur protéine taggée. De très nombreuses protéines sont ubiquitinées dans la cellule, un blot anti-Ub donnerait donc un profil général n'apportant rien.  [...] Je le regarderais plus tard. Malgré que ce western ne soit pas beau, il est tout de même interprétable. la protéine est ubiquitinée au bout de 20 minutes et cette ubiquitination perdure au cours du temps, ce qui veut dire, si ces temps sont sur cellules, que l'ubiquitination en question n'est pas de type à adresser au protéasome (K48) et que l'ubiquitination est stable (non réversée par des déubiquitinases).  [...]