• Forum - Intérêt, Sites, Restriction

PCR, template et riz anti-alzheimer

- pour faire cela, on prend des amorces sens et anti-sens (type AB-5'-HindIII et AB-3'-XhoI, donc entourant le gène d'intéret) contenant des sites de restrictions et on fait une PCR.  [...] 3) La découpe aux sites de restriction permet a) de récupérer le gène AB d'intérêt et b) de l'insérer dans les mêmes sites de restriction sur le plasmide commercial.  [...]

[Biologie végétale] Compréhension d'un article sur les OGMs

Pour moi, pour générer un OGM, on devait ajouter ou utiliser des sites de restrictions déjà présent et cliver ces derniers par une enzyme de restriction (ER) d'une part dans le gène d'intérêt que l'on veut ajouter dans l'OGM et d'autre part dans le plasmide ou vecteur qui transportera ce gène d'intérêt.  [...] Et donc, une fois obtenu notre gène d'intérêt en surproduction et purifié, c'est celui là qu'on est censé reprendre en 2.4 pour la suite de l'analyse, sinon le 2.2 aurait été inutile Ensuite on reprend donc la séquence qu'on amplifie de nouveau en PCR pour y introduire de nouveaux sites de restriction et recréer un vecteur qui sera cette fois inséré dans le tabac par la technique leaf disk (si j'ai bien compris).  [...]

[bio mol] pUC et LacZ

j'ai pas encore bien cerné le rôle du polylinker.s... je suis désolé mais quel est l'interet alors d'avoir une zone comportant un nombre important de sites de restrictions.  [...] Chaque enzyme de restriction reconnait un motif particulier au sein duquel elles peuvent catalyser la coupure du fragments. L'intérêt d'avoir une zone précise dans lequel se chevauchent des sites pour pleins d'enzyme te permet.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

Je ne comprend pas bien ta question. Pour construire un plasmide recombiannt tu as besoin de ta séquence d'intêret c'est à dire celle que tu veux intégrer dans le plasmide. Tu l'obtiens en l'amplifiant par PCR ou en digerant directement ton ADN par une enzyme de restriction.  [...] Ton fragement d'intêret peut possèder plusieurs sites de restriction spécifiques à l'enzyme utilisée. on obtient alors plusieurs fragments d'ADN dont un seul comprend le gène d'intéret. L'ADN plasmidique ne doit contenir qu'un seul site de restriction spécifique, au sein d'un gène de sélection.  [...]

PCR et plasmide-protocole article scientifique en anglais (dsl) non compris help!!!

Full length PCR product was purified by electrophoresis in a 1% agarose gel using the QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen) and was inserted into a pDONR/Zeo entry vector using a PCR Cloning System with the Gateway Technology kit (Invitrogen). Starting with this entry clone, the hASP DNA construct was cloned into a pDEST15 expression vector to obtain the DNA for the GST fusion protein.   [...] En survolant rapidement, il m'a semblé comprendre que c'est un premier plasmide qui te premet ensuite d'inserer plus facilement ton fragment d'interet dans tout types de vecteurs d'expression, sans avoir à te preoccuper de choisir tes sites de restriction, et de reflechir au sens.  [...]

[Génétique] phage

bonsoir. J'espere que quelqu'un saura m'éclairer. la partie centrale des phages peut etre utilisée comme vecteur de clonage. mais, est ce qu'on retire cette partie pour la remplacer par un adn d'intéret, ou est ce qu'on enleve seulement quelques morceaux pour en faire des sites de restriction d'une enzyme de restriction spécifique, et alors l'adn que l'on veut cloner serait ajouté dans la partie centrale.  [...] mais, est ce qu'on retire cette partie pour la remplacer par un adn d'intéret, ou est ce qu'on enleve seulement quelques morceaux.  [...]

[Biotechnologie] Composants d'un vecteur d'expression eucaryote

Ensuite, on a évidemment notre gène d'intérêt, son promoteur eucaryote, le signal de terminaison de la traduction, les sites de restriction (MCS) et le gène de sélection (auxotrophie le plus souvent ou résistance à un antibiotique). J'en suis à 7 (ou 6 si on compte les ORI pour 1).  [...] En fin d'épissage, le complexe EJC reconnaît un des facteurs du spliceosome et reste attaché aux jonctions exon-exon, ce qui permet au mRNA d'être exporté vers le cytoplasme. EJC ne s'associe pas aux mRNA si le gène ne contient pas d'introns. Si on enlève les introns d'un gène on constate que le mRNA est transféré vers le cytoplasme beaucoup plus lentement, d'où l'intérêt d'introduire ne fusse qu'un intron dans le gène à intégrer dans le vecteur.  [...]

[Biochimie] Manipulation de l'ADN: plasmide

Les plasmides utilisés en recherche sont souvent des plasmides très modifiés par les sociétés qui les vendent. Afin de pouvoir insérer facilement des portions d'ADN d'intérêt dans le plasmide, on a prit l'habitude de placer des sites de restriction. C'est à dire des sites reconnus par des enzymes capables de couper l'ADN.  [...] L'intérêt est de couper ET notre morceau d'ADN d'intérêt ET le plasmide avec le MÊME enzyme de restriction. Ainsi lorsqu'on les mets en présence l'un de l'autre, ils auront tendance à s'attacher et nous permettre de refermer le plasmide nouvellement constitué.  [...]

Projet clonage et expression d'un gène

Pour faciliter le clonage, il est possible d'ajouter à l'extrémité des amorces des sites de restriction (cohésifs, c'est mieux ). Une fois les amorces choisis et produites, la PCR peut se faire de deux manières. Soit sur colonie directement (prendre une colonie (ou moitié de)), puis amplifier directement l'ADN d'intéret (avec les bonnes température et temps d'élongation).  [...] Une fois que le résultat de l'amplification a été vérifier (et digérer) sur gel, il en possible de cloner le fragment d'intérêt dans le vecteur voulu (ici pET-15b).  [...]

[Biologie Moléculaire] Ajout de sites de restrictions

Ce qu'il faut faire c'est simplement prendre votre ORF et l'amplifier par PCR en ajoutant aux amorces les sites de restrictions+ 6 nucléotides aléatoires.  [...] En faisant comme cela, vous allez récupérer votre ORF borné par les sites de restriction. Vous n'aurez plus qu'à digérer et cloner directement dans votre plasmide d'intérêt.  [...]