• Forum - Glace, Préparation, échantillons

[Immunologie] Pourquoi réfrigérer le tampon FACS ?

Bonjour, tout est dans le titre, je me posais la question sur le pourquoi du comment on travaille sur glace lors d'une préparation d'échantillons pour la cytométrie de flux, ou alors plus simplement pourquoi le tampon FACS doit rester constamment au froid.  [...]

[Physiologie] Conservation de la matière fraîche

Il faut que tu te demandes aux gens de ton labo, qui recoivent des produits envoyés par les fournisseurs dans de carboglace, à ne pas le jeter. Tu le récupères et tu le mets en chambre froide jusqu'à la veille de ton départ par exemple où tu mettras ton échantillons bien protégé dedans.  [...] - Sinon, tu broies tes échantillons en poudre et tu les mélanges avec le tampon d'extraction. Tu les transportes alors en tubes à température ambiante. Pour les acides nucléiques ça ne risque pas grande chose mais pour les protéines, je ne sais pas. Je ne l'ai jamais fait.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transcription in vitro de sondes ARN marquées

Enfin bon, je lance ma transcription et j'ai des super rendements, les DO sont impeccables. Par contre à la migration de ces ARN après purification (lithium/ethanol) je vois des smears, et quelques bandes secondaires apparaitre. Le poids moléculaire de mes transcrits est aussi plus haut qu'attendu (peut-être à cause de la DIG ou de la biotine ).   [...] J'ai pourtant dénaturé mes échantillons 10min à 70°C (puis glace) avant l'électrophorèse. Il faudrait donc carrément faire une migration en agarose + formaldehyde.  [...]

[Biochimie] dosage enzyme pour quoi utiliser le bain-marie ?

1- Pour la préparation du tissu dans le tampon, on dit qu'il faut travailler dans la glace (4C°). Pour quoi broyer le tissus+tampon dans la glace Pour quoi le centrifuger à (4C°) Après la centrifugation, est ce qu'on doit remettre le tube dans le froid, jusqu'à la provocation de la réaction dans l'étuve du spectrophotomètre.  [...] Soit on veut empêcher que l'enzyme soit active durant la phase de préparation (car ainsi il n'y a aucun produit de formé, toute l'activité que tu verras par augmentation de l'absorbance sera du à des réaction se produisant à ce moment là), soit il y a d'autres enzymes ou inhibiteurs de ton enzyme dans l'échantillon qui pourrait dégrader ton enzyme d'intérêt.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot difficile d'une protéine de réparation de l'ADN

1/ Après récolte des échantillons cellulaires, effectuer 2 lavages des culots au PBS 1X contenant 1 mM de PMSF et 0,5 µg/mL des inhibiteurs de protéases suivants. aprotinine, antipain et leupeptine ( l e tout glacial ) entrecoupés de centrifugation 800 x g /2 minutes/4°C.  [...] 4/ Vortexer fortement puis soniquer les échantillons sur glace pendant 60 s, et alors là je n'ai pas compris comment déterminer les paramètres avec ce qui est dit dans l'article. microtips at limit, 40% duty cycle Je précise que je compte utiliser le Branson sonifier 150.  [...]

Enzymes Taq Polymérases - PCR

- La Taq pol standard n'est pas une hot-start. En effet certaines Taq du commerce le sont grâce à ce principe de l'inhibiteur qui se détache lors de la première dénaturation à 95°C. En fait le hot-start permet d'éviter toute activité de la taq avant qu'elle ne soit activée, notamment lors de la préparation de la PCR.  [...] En théorie, une taq hot-start permet de faire une préparation de PCR à température ambiante sans activer la polymérase, ce qui n'est pas le cas d'une taq standard. En pratique on fait tout sur de la glace à 4°C pour être sûr.  [...]

[Biologie Cellulaire] etude du niveau de phosphorylation d'une protéine en WB

Quels sont les meilleures conditions pour l'extraction et pour voir une différence de phosphorylation en western blot.   [...] Pour l'extraction, si tu veux conserver les phosphorylations de ta protéine, il faut de l'orthovanadate de sodium (inhibiteur de phosphatase) dans le tampon et éventuellement d'autres inhibiteurs. Mais surtout garder les échantillons dans la glace le plus possible une fois l'extraction faite, cela limite d'autant plus les déphosphorylations.  [...]

[Biochimie] Western blot eNOS

Je cherche depuis quelques temps a faire un western blot en utilisant un anticorps dirigée contre la serine 1179 phosphorylée de eNOS, sans succès.J'ai essaye plusieurs quantités de protéines, j'ai refait toutes mes solutions, j'ai vérifié les pH a chaque fois.   [...] Pourtant, les animaux sont sacrifies, leur hypothalamus est preleve et place dans un ependorf contenant du tampon de lyse (plus des antiproteases) plongé dans un bac de glace. La dessus nous broyons les echantillons au precyllis (temperature maintenue a 4 degres), le surnageant est recupéré puis mis dans un nouvel ependorf qui est jeté dans l'azote liquide.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR qui veut pas marcher

Je pense que sa peut surement venir au moment où je fais mon mix. La façon dont je le prépare. On me dit que la Taq, c'est fragile. Mais je fais comment pour prendre correctement la bonne concentration dans le tube si je l'agite pas un peu. Est ce que c'est déconseiller de vortex le mix avec la Taq dedans avant de mettre le tout au thermocycleur.   [...] Pour la préparation du mix je fais sa sur un portoir classique sans glace, juste sous une hôte pour éviter toute contamination de mes tubes et mes mix.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pb de Taqman sur miRNA

Est ils possible que les echantillons que j'utilisent se degradent (Les cDNA souffrent ils des decongelation/recongelations succesives).  [...] Sinon pour les Ct, tu as deux échantillons qui sortent bien. Ce sont tes contrôles peut-être Moi j'utilise RNU48 comme standard de normalisation. Sinon les Ct que j'obtiens sont variables en fonction des miRs, il m'est arrivé d'en tester des très peu exprimés et ils ne sortent pas aussi tôt (voir par du tout ) que dans mon exemple.  [...]