• Forum - Fixation, PAF, Liaisons, Protéines

fixation des cellules

La fixation PAF te créé des liaisons covalentes entre les NH2 de tes protéines. Le méthanol (perso je l'utilise froid, sortit du congélo -20°C) dénature et précipite tes protéines.  [...] La méthode de fixation par la formaldéhyde va créer des ponts entre les protéines ce qui permet une conservation de la localisation. De plus les lipides ne sont pas solubilisés. C'est pour cette raison qu'il faut perméabiliser tes membranes avant de faire une manip d'immuno par exempl.  [...]

[Biologie Cellulaire] Fixation de la Mcherry

je souhaite fixer des cellules musculaires exprimant la protéine fluorescente MCherry dans l'ensemble de la cellule (noyau + cytoplasme). Cependant, j'ai utilisé le même protocole que pour la fixation de cellules exprimant la GFP (fixation par le PAF à 4%).  [...] Après fixation, j'ai pu observer que la MCherry avait été dégradée. Connaissez vous d'autres fixateurs compatibles avec la MCherry.  [...]

Différence de fixation des cellules

Bref, tout ca pour vous demandez si vous savez pourquoi on observe une telle différence entre les deux fixations, pouvant expliquer ce que j'ai pu observer. Je sais que le PFA crée des liaisons covalentes entre les cellules, et que l'ethanol aura plutôt tendance à coaguler par deshydration les protéines, mais je sais pas pour autant expliquer ce résultat.  [...] Avec le methanol, la fixation s'effectue par deshydradation (denaturation des proteines) alors qu'avec les aldehydes (formaldehyde, glutaraldehyde) on conserve la structure 3D de la proteine (fixation par pontage). Donc effectivement, si tu utilises un anticorps conformationnel, la detection de ton antigene sera impossible apres une fixation en methanol.  [...]

[Biologie Cellulaire] pbs et pbs tween

- as a washing agent in immunoassays, such as Western blots and ELISAs. It helps to prevent non-specific antibody binding. In this major application, it is dissolved in Tris-Buffered Saline or Phosphate buffered saline at dilutions of 0.05% to 0.5% v/v. These buffers are used for washes between each immunoreactions, to remove unbound immunologicals, and eventually for incubation solutions of immunoreagents (labeled antibodies) to reduce unspecific background.   [...] merci pour vos réponse j'ai pu en faire une petite déduction plus ou moins cohérente, je ne pense pas que le tween sert ici pour rendre la membrane poreuse vus que j'utilise ensuite de la proteinase K pour cela. je pense que ca doit être pour enlevé la PAF et limité les fixation non specifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème DAPI & Cellules

Je viens à vous car je suis un peu déspespéré. Voila maintenant un long moment que je travail avec des HEK 293 ECACC sur lesquels je réalise des immunocytochimie afin de marquer une protéine. Au départ tout fonctionnait bien mais depuis quelque temps j'obitiens des résultats étrange avec mon marquage au DAPI.  [...] Je travail donc sur des HEK 293, elles sont utilisée sans antibiotique et ne sont pas contaminées. Pour la fixation. PAF 4%. Le DAPI est ajouté a la fin durant 5 minutes. Puis les lamelles sont montées sur une lame à l'aide de MOWIOL. Merci de votre aide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Fixation au Zinc

Les cations divalents (surtout Ca2+ pour les liaisons des cadhérines) sont très importants pour l'adhérence des cellules à un support. La preuve c'est qu'une incubation de cellules adhérentes pendant une dizaine de minutes avec de l'EDTA suffit à les décrocher.  [...] Mais, j'ai lu récemment plusieurs papiers vantant les bienfaits de la fixation par le zinc. Cette technique aurait pour avantages de conserver la morphologie, tout comme les fixateurs de type formalin, de garder intact les acides nucléiques (PCR possible derrière), ce qui n'est pas possible ou alors très hasardeux avec le PAF et sa famille, et enfin, il semblerait que cette méthode de fixation conserve un plus grand nombre d'épitopes à l'état natifs.  [...]

problème d'hybridation in situ

bonjour a tous et a toute, je fait des hybridation in situ sur coupe d'éponges que je révèle au nbt/bcip, les morceau d'éponges sont fixé a la paraformaldéhyde et sont inclus en paraffine, les coupes font 10 µm d'épaisseur. et j'ai un problème. avec mon témoin actine qui devrait être coloré de façon homogène j'obtiens ceci. test 2 actine ' grad.jpg.   [...] Peut-être en retraçant avec produits/kits le(s) protocole(s) que vous avez suivi(s) C'est un peu succinct pour cerner le problème, surtout depuis un forum ^^.   [...]

[Evolution] les limites de la plasticité génomique des espèces?

En gros, une mutation favorable va être conservée, une mutation sans impact peut l'être, une mutation défavorable conduit le plus souvent à la mort de la cellule, tout cela en considérant quel gène est touché, est-il dupliqué, quel est son rôle, si c'est un gène de type II, quel domaine précisément de la protéine codée est touchée (domaine catalytique crucial ou domaine structural un peu modulable ).  [...] Il peut y aussi avoir carrément des recombinaisons, par exemple une séquence génique qui correspond à un domaine protéique particulier qui est recombinée au sein d'un gène existant. et PAF, te voilà avec une protéine qui possède un domaine supplémentaire, donc une fonction additionnelle ou modifiée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Molécule coloration ADN / électroporation / levure

Je cherche une molécule qui, lorsqu'elle arrive à pénétrer dans une cellule, produit une coloration (pas de fluorescence, quelque chose de visible ou de mesurable par simple photo ou spectrophotométrie).   [...] Une protéine fusion avec un DNA biding domain, et un domaine actif enzymatique (de type Beta-Gal)... Une fois l'électroporation terminé, il suffit d'y ajouter le substrat (X-Gal ou ONPG).. et paf une simple lecture au spectro. Seule difficulté mettre au point la protéine fusion.  [...]

[Biochimie] PAF facteur d'activation plaquettaire

A plusieurs reprises dans mes cours (de première année de médecine) les profs nous parlent du PAF sans jamais donner de véritables explications sur ce facteur coagulant.  [...] Par ailleurs dans mes cours il semblerait qu'il soit classé dans les lysophospholipides (mais ce n'est pas très clair) alors que wikipédia le classe dans les plasmalogènes. appartient-il à une classe de glycérophospholipide particulière.   [...]