• Forum - Expérience, Western, Anticorps

[Immunologie] hypothése et solution pour une probléme d'immunomarquage

As-tu essayé différents anticorps dirigés contre le même ligand (ce sont des facteurs de croissance je suppose...) Car certains anticorps marchent bien en western mais mal en IF ou IHC, pour d'autres c'est l'inverse. Seule l'expérience le dit.  [...] Dans le cas où ta méthode a été validé par une autre équipe et publiée avec ces anticorps là, il ne faut pas hésiter à écrire à ces équipes pour connaitre leurs conditions expérimentales. Tu met ton directeur de recherche en copie visible pour mettre du poids à ton mail et normalement ils devraient te répondre.  [...]

[Biologie Cellulaire] mise en evidence des protéines membranaires

Sinon tu peux tenter une experience de fractionement cellulaire, et tu montres par western-blot que ton anticorps reagit avec la fraction membranaire.  [...] Tu peux très bien le faire par bombardement pour faire de la colocalisation avec de la RFP et de la GFP par exemple et observé au microscope si il y a superposition des fluorescences avec un organite de la cellule, ainsi tu pourra conclure que ta protéine est membranaire et se fixe à tel ou tel organite.   [...]

[Biochimie] Conservation d'anticorps

J'aimerais savoir si certains d'entre vous ont une expérience en terme de milieu de conservation d'anticorps. je purifie des anticorps à partir de sérums humains, mais la conservation en glycérol ne préserve pas l'activité de mes anticorps dans le temps. Pour être plus précis, les anticorps que je purifie sont destinés à de l'immunocapture, mais au bout de quelques jours seulment l'activité biologique d'immunocapture disparait alors que mes anticorps sont toujours fonctionnels en western blotting ou en immunofluorescence.  [...] Je conserve mes anticorps aliquotés congelés à -20°C en PBS. Quand je décongèle un aliquot, je le garde à 4°C. Je n'ai, en général, pas de problème pour mes applications (FACS, WB, immunofluorescence). Je ne fais pas d'immunocapture et je ne peux donc pas répondre à des questions qui seraient spécifiques à cette technique.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot flou

C'est bizzare. Quand je fais un petit gel à 10 %, il migre à 100 V 2 H maxi. Le problème vient peut-être du tampon trop faible en ions (vérifie les concentrations ainsi que les réactifs stocks) et peut-être aussi de ta cuve. Si les bandes sont floues c'est plus un problème de migration que de transfert je pense.   [...] De toute façon, un western, ça marche jusqu'au jour où cela ne marche plus alors qu'on procède de la même façon et là, on remet tout en cause sans pour autant trouver le problème. Crois-en mon expérience. Quand tu as un doute, tu recommences en priorité toutes les solutions puis tu vérifies si tu as changé de lot d'anticorps par exemple ou de référence de produit.  [...]

[Biochimie] lyse cellulaire

je vais faire un western blot avec le sérum contenant les anticorps après infection d'un animal et par là je détermine les protéines immunogènes.  [...] Si vous faites un western blot avec un pool d'anticorps dirigés contre des antigènes du parasite, votre expérience sera spécifique de ces antigènes là. Les antigènes de l'hôte ne seront pas détectés vu que les anticorps proviennent de l'hôte en question (sinon ce seraient des anticorps auto-immuns).  [...]

[Biochimie] anti LC3 humain aucun marquage en Western blot

Bonjour, est ce que quelqu'un a une experience de western blot sur extrait de cellules humaines avec l'anticorps de lapin anti human MAP LC3 beta (H-50) sc-28266 de chez santa cruz biotech (marqueur d'autophagie). Je ne sors aucune bande specifique vers les 16-18kDa attendus avec des extraits de HeLa pretraitées ou non pour favoriser l'autophagie.  [...] Une autre personne avait eu un problème pour détecter LC3 en Western Blot. Anti-LC3. Etant donné qu'une personne de mon équipe fait des WB anti-LC3 de temps en temps et qu'ils marchent, je vous donne à vous aussi le lien commercial vers cet anticorps, par MP.  [...]

Immunohisto

Cependant. 1) en western, si l'anticorps est suppose reconnaitre un site qui peut etre modifie (phosphoryle, clive, episse, acetyle, palmytoyle...), il se peut que en fonction du tissu, la proteine soit ou non modifiee a cet endroit et donc ne lie plus aussi bien l'anticorps en western-blot.  [...] Comment expliquer que mon anticorps (spécifique de l'état phosphorylé d'une protéine) se fixe sur le tissu cérébral dans une structure Y (donc il marche.), mais pas dans la structure X (y a rien du tout de marquer.) où l'on observe du marquage en western avec le même anticorps.  [...]

Différence de fixation des cellules

Faut un peu se méfier de tout ce qui est immuno. Le résultat dépend grandement de la conformation de la protéine au moment où vous faites votre manip. En principe, les anticorps sont testés en western blot. Si il n'y a qu'une bande et de la taille attendue, c'est jugé comme bon et l'anticorps est déclaré spécifique.  [...] Non là je ne suis pas tout à fait d'accord. La plupart des anticorps sont destinés et testé pour un usage particulier. Rien que chez Cell Signaling pour ne pas la citer, les anticorps sont validés pour une ou plusieurs manipe définit (western, If, immunohistochimie, immunoprécipitation,  [...]

Problème RT-PCR sur cDNA

j'ai séquencé deux sortes de cDNA, et seul l'un d'eux contient les cicatrices d'introns...je devrais peut etre poursuivre la piste d'un épissage alternatif.   [...] Une autre possibilité. un Western Blot avec un anticorps specifique du peptide que donnerait cet intron s'il était traduit. Si le Western est positif alors tu auras prouvé que cet intron est inclus et tu pourrais même estimer la quantité avec un anticorps contrôle spécifique d'une autre partie de ta protéine.  [...]

Le système immunitaire

@dudu45slim. Mes excuses encore, et Cyrille999 t'as donné de bonnes références en immunologie. Pour revenir sur ton exemple du VIH, le problème n'est pas tant de produire les anticorps. Ces derniers sont bien produit (tu pourras le vérifier sur les ouvrages) mais il possède un tel taux de mutation que les anticorps ainsi produit ne reconnaissent pas les nouveaux virus produits.  [...] Le principe de la reconnaissance d'un antigène par un anticorps (en dehors de la physiopathologie) a été adapté et est utilisé comme outil technique par des millions de personnes chaque jour (dont moi) en recherche fondamentale ou clinique, pour réaliser de nombreuses expériences dont les fameux tests ELISA, Western Blot, immunoprecipitation et des dizaines d'autres.  [...]