• Forum - Enzyme, Restriction, Digestion, Fragment, ADN

[Biologie Moléculaire] Polymorphisme et RFLP

Par exemple, les RFLP sont des polymorphisme de longueur des fragments de restriction... c'est donc juste la variabilité de longueur de fragment d'ADN après digestion enzymatique Rien de plus complexe.  [...] Dans ce cas ce qu'il faut voir c'est que l'enzyme de restriction coupe l'ADN en un certain endroit, qui contient un certain motif. Si la longueur du fragment est différente c'est que le motif n'est pas au même endroit, ou encore que le motif attendu à l'endroit usuel n'existe plus, donc c'est qu'il y a une mutation quelque-part dans le motif.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

sur ce genre de manip c'est souvent la digestion du produit de PCR qui s'effectue mal. en effet les enzyme ont des difficulté pour coupes aux extremites un fragment d'ADN linéaire.  [...] En fait je digère avec XbaI (qui se liguera à SpeI en perdant le site de restriction donc) et avec SacII pour l'autre extrémité... Après digestion, extraction sur gel et purification, je procède à la ligation... et à mon avis le problème c'est ça.  [...]

[Biologie Moléculaire] Polymorphisme de restriction

Ce que vous appelez marqueur c'est simplement une mutation dans un site de restriction qui va faire qu'un fragment d'ADN, obtenu à partir d'un gène donné, va être coupé, ou non, par une enzyme de restriction, selon que le gène est sous la forme d'un allèle, ou d'un autre.  [...] En gros quand la mutation est présente l'enzyme de restriction est incapable de reconnaître son site de restriction et ne va pas le couper.  [...]

Plasmide recombinant

J'ai un petit problème en génétique, alors dans plusieurs exercices on me demande de faire la carte de restriction d'un plasmide, suite une simple et ensuite une double digestion, là c'est bon, mais après quand on me dit qu'on hybride le plasmide recombiné après la double digestion avec une sonde formée par l'ADN copie, alors ici j'arrive même pas à comprendre d'ou provient cet ADN copie, autrement dit il est la copie de quel ARNm au juste et puis on me donne la taille des fragments obtenus (après hybridation) et on demande de trouver la taille du fragment et ou il est placé.  [...] Ton plasmide a été coupé par deux enzymes de restriction différentes, on ligue ensuite un insert. S'il s'agit d'une rétrotranscription d'un ARNm, on parle d'ADN complémentaire et pas d'ADN copie. Pour la compréhension de ton exercice, je pense qu'on s'en fiche de savoir d'où vient cet ADN à liguer.  [...]

[Biologie Moléculaire] enzyme de restriction

est il possible d insérer un fragment d adn dans un plasmide linéarisé par une enzyme de restriction non palindromique.  [...] sinon on peu toujours remplir ou grignoter les extremités ce qui les rends franches et permet le clonage de n'importe quoi.   [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

la digestion je la fais géneralement avec 1,5 µl d'enzyme 1Hà 37°C. mais comme le signal obtenu après dépos sur gel est trop faible, j'ai augmenté la quantité d'ADN digeré (80µL dans 350 final) avec 5µl d'enzyme de digestion 1h 37°C(j'ai essayé d'amplifier le fragment par pcr, ça ne marche pas).  [...] après dépos sur gel le signal raltif à mon fragment d'interet reste faible (rapport incorrect avec l'autre fragment )mais les bandes plus visibles pour faire l'élution des bandes(kit gel extraction). j'ai déposé un aliquot à la fin d'élution j'ai eu encore un signal très faible (21ng/µL).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problèmes: Recombinaison d'un plasmide

Il faut que tu amplifies ta séquence par PCR en choisissant bien tes amorces. Il faut qu'elles soient complémentaires aux extrémités de ta séquences avec en plus une courte séquences qui ne correspondent pas à ton gène mais qui contiennent une séquence de restriction (on ajoute généralement quelques bases supplémentaires qui ne correspondent à rien et qui vont permettre à l'enzyme de bien se poser sur tes fragment lors de la digestion.  [...] Oui c'est ça. Par convention on utilise N pour signifier que cela peut-être n'importe quelle base. Ici j'ai mis 4N à côté des sites de restrictions mais cela peut varier suivant l'enzyme que tu utilises. Dans ton cas, ce n'est pas important je pense.  [...]

[Biologie Moléculaire] Erreur de taille sur SDS-PAGE

Deuxièmement je voudrais savoir si il fallait un distance minimum de part et d'autre d'un site de restriction pour que l'enzyme clive le double brin d'ADN. Là aussi je précise mon idée. J'ai un site de restriction qui se trouve 71pb avant la fin du fragment d'ADN et je voudrais savoir si c'est possible que l'enzyme ne le vois pas.  [...] Pour le SDS je ne sais pas.Mais pour la restriction, il ne devrait pas y avoir de problème.On peut bien creer des fragment PCR avec juste un site de clivage de chaque coté et les cliver ensuite.Je sais pas si mon exemple et très clair, mais toujours est-il que je suis quasi sur que ça ne posera pas de problème.  [...]

[Génétique] Thérapie génique: synthétiser le gène correcteur

Pour cela il faut faire le découpage de l'ADN, grâce a des enzymes de restriction.  [...] Les enzymes de restriction vont découper l'ADN en fragment, et en fait sur l'ADN il y a des sites de restriction spécifiques pour plusieurs enzymes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction VS fragment d'ADN

Je pense que deux paires de bases c'est peut-être insuffisant pour permettre la digestion. j'avais l'ahabitude de mettre 4 à 5 base en amont de mon site de restriction, donnant un design d'amorce de ce genre.  [...] Voilà. l'idéal, si tu peux te le permettre, c'est avoir des sites de restriction différents sur tes amorces sens et antisens, comme ça lorsque tu fais ta ligation, pas de fermeture du vecteur sans insert, et pas df'insert dans le mauvais sens. (Je pense que ton vecteur possède un polylinker.).  [...]