• Forum - Cycles, Courbe, Fusion

[Biochimie] qPCR :

Personnellement, mes qPCR comprennent 50 cycles. Au-dessus de 40 cycles je n'ai jamais eu de résultat précis et interprétable. Par contre pour des gènes sortant entre 30 et 40 cycles, c'est très intéressant puisque j'arrive à obtenir des courbes de fusion parfaites, grâce aux 50 cycles.  [...] Mes 10 cycles supplémentaires n'ont donc pour but que d'avoir une belle courbe de fusion, précise, qui permet de voir d'autant mieux la présence de produits non spécifiques. Le plus couramment utilisé est 40 cycles mais j'ai pu voir dans quelques publications des auteurs pousser jusqu'à 50 cycles, ce qui m'a décidé de faire pareil.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment analyser les résultats de PCR quantitative???

Je ne comprends pas trop votre problème. Pourriez-vous joindre une image de votre courbe de fusion D'après ce que je comprend, la valeur finale de fluorescence de vos puits ne dépasse pas la valeur seuil Il n'y a donc pas de Ct Votre qPCR est programmé pour combien de cycles Car ce qui est surprenant c'est d'avoir une belle courbe de fusion tout en ayant un gène trop faiblement exprimé pour dépasser la valeur seuil.  [...] Ce que tu dis Piwi m'intéresse fortement. Si tu penses qu'il est dommage de se délester de gènes sortant au-delà de 35 cycles, cela veut certainement dire que tu as obtenu des courbes de fusion validant des quantifications sur de tels gènes. Donc des courbes de fusion où l'on voit se dessiner un pic.  [...]

[Biologie Moléculaire] QPCR, courbe Tm?

Si ces primers sont connus pour etre bons, (teste par ton labo avec courbe de fusion a l'appuis ou publie et sans moyen de regarder les courbes), alors c'est soit quelque chose qui a change dans ta manip (origine du mix annealing concentration des primers etc) et si ce n'est pas le cas, c'est que soit tes primers sont devenus mauvais avec le temp (ou contamine par quelque chose) soit que ton ARN/cDNA est different et qu'il requiert une optimisation (genre quantite d'ARN plus faible, du coup moins de cDNA, du coup les primers sénnuient et se dimerisent ).  [...] As tu vérifié que rien n'a été modifié dans le programme du Lightcycler concernant le nombre de cycles de PCR, l'étape de fusion (en particulier la vitesse de variation de température en °/s ou le nombre d'acquisition par seconde (sur LC480)) par rapport aux manips où les courbes de fusion étaient OK.  [...]

[Microbiologie] pcr en temps réel

Alors tu dois avoir une courbe où la fluorescence est au début à zéro. Dans ce cas, le Ct est le cycle où la fluorescence commence à augmenter de façon exponentielle, comme indiqué ici.  [...] Concrètement, même si c'est vrai qu'en pratique on ne le calcule pas, le Ct correspond au nombre de cycles au bout duquel on obtient le point maximum de la fonction dérivée de la courbe représentant la fluorescence en fonction du nombre de cycles de PCR. Autrement dit, c'est l'abscisse du point pour lequel le coefficient directeur de l'exponentiel est le plus élevé. Voilà.  [...]

[Biologie Moléculaire] Courbes PCR en temps réel

Pour s'assurer de la spécificité de l'amplification, on réalise a la fin des cycles d'amplification une rampe de température qui permet de déterminer le point de fusion des produits formés. Pour cela, on fait passer la température de 55 à 85° par petits intervalles tout en mesurant la fluorescence.  [...] Au fait, je viens de lire de ton message un peu en retard car j'ai passé mon exposé cette aprémidi, n'empeche que pour la courbe de fusion, j'ai pas dit tout ce detail, enfin juste que que le fai que tous les échantillons presentent le meme pic de température donc c'est bien le gène recherché avec quelques définitions, de courbe de fusion et Tm, pour le premier graphe je l'ai analysé de la même manière que toi avec plus de détail.  [...]

Gène de ménage (gène de référence...)

je crois qu'il y a des spécialistes de la qPCR sur le forum, donc, à voir pour plus de précision. Sur le principe, quand tu fais une (RT-)PCR, tu sais que la quantité d'ADN augmente avec le nombre de cycles, suivant une courbe en S, avec une phase exponentielle au milieu.  [...] Le Ct(gène d'intérêt) est donc le cycle où commence la phase exponentielle pour ton gène d'intérêt. Le Ct(contrôle) est le cycle où commence la phase exponentielle pour un gène de référence(dans le même tissu.), le fameux gène de ménage dont l'expression ne varie (quasiment) pas.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation PCRq en temps réel (SYBER Green)

Tout d'abord, je dirais qu'il te faudrait une validation expérimentale de ton résultat brute en Ct (as tu des blanc dans ta qPCR afin de savoir à partir de quel cycle sort le signal non spécifique), avez-vous réaliser une courbe de melting permettant de visualiser la spécificiter de ton amplicon.  [...] Dans le cas du dimer, il arrive que les primer s'hybrident entre eux et s'amplifient. Il faut toujours avoir un regard critique sur les intensités de fluorescence en sortie de qPCR et surtout vérifier la spécificité via une courbe de melting à la fin de tes cycles de qPCR, mais à priori vous n'en avez pas faites durant votre TD.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel (qPCR)

the crossing points (qui nous montrent le nombre de cycles necessaires à chaque ADNc pour que sa courbe commence à augmenter). Ma question est de savoir comment procéder pour traiter ces résultats (the crossing points).  [...] Je vous remercie d'abord pour vos réponses, cependant, j'aimerais bien signaler que la courbe de fluorescence est exponentielle, donc la quantité d'ADNc augmente via une equation expionentielle, jusqu'à ce que les sites d'action des polymérase soient tous saturés, on passe alors à la partie linéaire de la courbe.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment analyser les résultats de PCR quantitative??? - Page 2

Ben oui, j'ai des courbes de fusions pour chacun des gènes que j'étudie (en Sybrgreen). Passé 40 cycles ce n'est plus au top évidemment mais encore une fois, il ne faut pas le bébé avec l'eau du bain.  [...] donc ma question est la suivante. vue que c'est un virus à ARN, faut-il cloner le gène dans plasmide et réaliser un courbe de dilution ou bien existe-il une autre méthode si parmi vous une personne a eu a faire un travail similaire, je suis ouvert à toutes vos suggestions et enfin, est ce que quelqu'un parmi vous disposerait d'un protocole à suivre afin de réaliser cette quantification.  [...]

Micro-adénome hypophysaire - Page 2

Mon endocrino me laissait 3 mois car elle avait peur que mon adénome perturbe également 2 autres hormones qui gèrent l'ovulation.Et au mois de mars j'apprenais que j'etais enceinte...(j'ai fait mes courbes de températures pour savoir mes jours d'ovulation).  [...] depuis j'ai arreté le norprolac.Sous traitement mon taux de prolactine etait bien redescendu et j'avais bien récupéré mes cycles.donc si tu veux tombé enceinte n'arretes surtout pas le traitement afin de récupérer tes cycles normalement.C'est après qu'il faudra l'arreter.Je te souhaite bon courage et bonne chance.  [...]