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[Biologie Cellulaire] transfection

oui ms le plasmide il est capable de réplication autonome c'est pareil pr mon ptit ADN seul ce que je veux dire c'est que si je taggue un ADNc avec de la GFP par ex et que je transfecte tt ca, jvais bien obtenir une protéine tagguée avec la GFP.  [...] Pour faire une selection des cellules transfectées, il faut par exemple que le plasmide possède un gène de résistance à un antibiotique (puromycine par exemple), ainsi seules les cellules transfectées vont survivre pendant une culture en présence de l'antibiotique.  [...]

Techniques utilisées en lab de biomol - Page 2

Oui, si ton plasmide n'a pas intégré l'insert, ta bactos va mourrir parce que dans le milieu de culture tu mets un antibiotique. Mais le vecteur que tu as inseré dans ta bactérie possède le gène de résistance à cet antibio ce qui permet de faire une première sélection antre bactos avec plasmide et bactos sans plasmide.  [...] Ensuite, pour savoir si ton plasmide a intégré l'insert ou pas, tu utilises un autre système de sélection comme par exemple le Xgal et le gène LacZ.  [...]

[Génétique] Production d'interleukine 2

Puis tu fais une culture sur boite de petri avec une sélection par un antibiotique correspondant à ton plasmide. De la tu repiques une colonie et tu fait une culture liquide à partir de cette dernière. A cette étape il est important de valider ta construction par un séquençage et une PCR, après avoir extrait une petite quantité de ton plasmide (ex.5ml de culture extrait par mini prep).  [...] Pour produire la protéine à partir de là, il faut que tu réalises une transfection en cellule eucaryote (HEK293 par exemple) en utilisant un agent de transfection (lipofectamine...). Tu appliques également une pression de sélection par un antibiotique. Là il va falloir attendre un peu et comparer la mortalité de tes cellules avec des HEK non transfectées également sous antibiotique.  [...]

Plasmide recombinant

En fait, dans le plasmide, on place souvent un premier gene de resistance à un antibiotique dans la région de recombinaison. Ceci pour pouvoir selectionner les vecteurs recombinants. Faciel et instinctif je dirais.  [...] L'autre antibiotique permet la sélection dans un autre type de cellule (une culture cellulaire ou primaire). C'est l'étape de l'analyse, de l'essai biologique. par exemple quel sera l'effet du plasmide sur les cellules humaines.  [...]

marqueurs de sélection

Ce gène est appelé marqueur de sélection. Deux types de marquer de sélection sont utilisés chez les levures. des gènes permettant de complémenter une mutation auxotrophique ou des gènes conférant la résistance à un antibiotique ou à un agent toxique.  [...] non tu insère ton gène dans un plasmide qui contient la resistance a la selection (bien souvent un gène de resistance a un antibiotique).  [...]

Problème lors de ligation

Je fais rentrer mon plasmide dans mes bactéries compétentes en faisant un heat chok, puis je dépose sur agar avec l'antibiotique de sélection.  [...] Le deuxième vrai soucis c'est qu'après l'extraction de plasmide (après repiquage des colonies en milieu liquide) je redigère pour vérifier que tout a bien fonctionné et la j'obtiens un smir.  [...]

[Génétique] Enhancer trap

Admettons que tu veuilles insérer deux gènes, A et B. Sur le plasmide a, tu y mettras un facteur de transcription (exogène) + gène A. Sur un plasmide b, tu y mettras l'enhancer (spécifique du TF) + gène rapporteur + gène B. Ensuite, tu sauras que les colonies qui expriment le gène rapporteur ont forcément les deux plasmides intégrés.  [...] Généralement le gène de sélection procure une résistance à un antibiotique ou à l'environnement de culture, ou simplement colore les colonies.  [...]

mode de resistance aux antibiotiques

En plus, pour sélectionner les bactéries qui ont incorporé le plasmide avec le gène d'intérêt, on met sur ce même plasmide un gène de résistance à un antibiotique. On met en culture les bactéries dans un milieu avec l'antiobiotique en question (sélection artificielle) pendant une nuit.  [...] Cette pratique est fortement critiquée parce qu'on donne sciemment la résistance à l'antibiotique à une bactérie. Mais d'autres marqueurs de sélection sont en cours de conception (par exemple, mettre dans le plasmide un gène permettant à la bactérie d'utiliser un sucre inédit, comme le xylulose).  [...]

Plasmide et gène LacZ

Pour cela on utilise un gène de sélection. Le plasmide ci-dessus possède un gène Ampr, qui procure à la bactérie un caractère de résistance à un antibiotique. l'ampicilline. En milieu contenant de l'ampicilline, seules les bactéries ayant intégré le plasmide pourront survivre.  [...] Je pense qu'il y a une erreur parce que les bactéries non transformantes ont déjà été éliminées par l'action de l'antibiotique (Amp). Le système LacZ permet de différencier les bactéries (ou colonies) qui ont un plasmide avec l'insert (bactéries transformantes recombinantes) et celle qui ont le plasmide sans l'insert (bactéries transformantes non recombinantes) de part la couleur des colonies observées sur boîte de Pétri (si le milieu est préparé avec de l'IPTG et du XGal).  [...]

[Biologie Moléculaire] Question purification QIAprep

Malgré les rapports à écrire, il faut que les manips avancent un peu... J'ai envoyé mes plasmides recombinants à séquencer, mais la qualité de l'ADN n'était pas vraiment terrible. Ce que je ne comprends pas, c'est. pourquoi Je fais des précultures avec mes antibios (kana et chloramphénicol) en milieu minimum sur lesquelles je fais les QIApreps (20 ml de préculture à DO600 = 1.  [...] Si ta souche n'exprime pas une cat, ca s'explique facilement par le stress cause par ton Cm. Tu ajoutes un antibiotique pour lequel ta souche ne semble pas etre resistante (d'ailleurs si c'est pas pour conserver un plasmide, interroge toi sur le pourquoi de cette selection.  [...]