• Forum - Contrôle, Charge, Western

[Vocabulaire] Protéine domestique.

House keeping gene sont des gènes qui s'expriment de manière constitutive ou du moins très peu régulé tel que GAPDH etc dont on se sert souvent comme contrôle par exemple pour les qPCR. Il en va de même pou une protéine, dont on se sert par exemple comme contrôle de charge pour les western (actine, clathrine, tubuline etc).  [...] Salut Camulus et toothpick-charlie, merci c'est plus clair à présent. Comment fait-on ce contrôle dans les qPCR on utilise l'hydridation avec un sonde complémentaire des house keeping ^^ (Juste par curioisité.).  [...]

[Génétique] Western blot

Je suis actuellement étudiante en Master 1 de génétique et je fais mon stage dans un labo de génétique et je fais beaucoup de Western Blot sur des lysats issus de lignées de liposarcomes. A chaque révélation des bandes, je constate que les bandes du contrôle que je met (la tubuline) ne sont pas identiques d'un puit à l'autre ce qui suggère que je n'ai pas déposé la même quantité de protéine dans chaque puit, mais pourtant je fais bien attention de bien déposer la même quantité de 20µl par puit (30µg de prot pour un QSP de 40µl avec du tampon de laemmli et du tampon de charge.  [...] en fait il est très souvent difficile de réaliser exactement le même dépôt, d'où ces variations. De plus, suivant la méthode utilisée pour doser la concentration en protéine on est +/- précis. C'est pourquoi normalement pour toute quantification on utilise un rapporteur interne qui normalement ne varie pas dans les conditions testées (souvent l'actine ou la tubuline) et on rapporte le signal obtenu pour notre échantillon au signal obtenu pour le rapporteur (une division quoi ^^).   [...]

[Biologie Cellulaire] Extraction proteines nucleaires

J'ai deja fait des extraction de proteines Noyau/cytosol mais mon protocol (qui ne contient pas d'ultracentrifugation) n'est pas tres propre. Dans le sens ou il enrichit les fractions mais celles-ci contiennent des contaminations des autres compartiments.   [...] J'ai fait une premiere manip avec le kit NER, je n'ai pas encore le resultat, le western est en cours mais peut-tu me dire quels controles de charge noyau/cyto tu utilise Surtout que j'ai des condition avec de la Leptomycine B qui bloque le transport nucleaire et bloque notamment l'actine.  [...]

western

je souhaite savoir quel controle est habituellement utilisé lorsque l on souhaite effectuer un western sur des proteines nucleaires.  [...] Mais on utilise pas forcément l'actine pour les cytosoliques. Ca dépend de ce qu l'on recherche, il n'y a pas vraiment de contrôle positif universel.  [...]

[Biochimie] Expression protéique

La protéine est détectée par Western blot et le contrôle positif est correcte. A quel niveau sont sensé agir les régions régulatrices Lors de la traduction N'est ce pas un peu tard une fois que les ARNs sont synthétisés.  [...] L'ARN semble suffisamment exprimé puisqu'il est détecté assez clairement avec 30 cycles d'amplification. Sur WB j'obtiens deux bandes de tailles différentes pour mon contrôle positif mais seulement une bande très très haute dans le gel (très grosse protéine) comparé aux autres dans le reste de mes conditions.  [...]

[Biochimie] Contrôle d'inhibition de la dégradation lysosomale

J'inhibe la dégradation par les lysosomes (avec plusieurs concentrations de leupeptine) et j'aimerai trouver un contrôle positif de mon blocage c'est à dire une protéine qui s'accumule sous leupeptine en western.  [...] Oui un récepteur ca aurait pû convenir mais je travaille en cellule S2 (pool de cellules embryonnaires de drosophile) et je ne sais pas trop qui est exprimé et qui ne l'est pas. Je recherche donc une protéine TRES ubiquitaire.   [...]

[Biologie Cellulaire] Controle pour Western blot

Je souhaite faire un western blot sur un extrait de protéines nucléaires mais je ne trouve pas de protéine à utiliser comme controle. Auriez-vous une idée de la protéine généralement utilisées pour cela.  [...] histone H3 me semble pas mal (sauf si vous testez des cellules avec justement l'insertion d'isoformes spécifiques des histones. par exemple et principalement le testicule).   [...]

[Biochimie] Recette du bleu de bromophénol (BBP)

quelqu'un connait il la recette de base du tampon de charge BBP. Il me semble que c'est Sambrook (et al) d'où nous vient cette recette mais j'ai beau chercher dans la littérature je ne suis pas sûre d'avoir la bonne.. ça change à chaque fois.  [...] Tu veux la composition du tampon de charge de western blot Dans ce cas, pour du 5X. 60 mM Tris-HCl pH 7,4, 40% Glycérol, 10% SDS + une micropincée de BBP (j'ai pas plus précis, c'est a bisto de naz ).  [...]

utilisation de logiciel image J

Je voudrai analyser mes résultats du western blot avec le logiciel Image J, j'ai une question pour les personnes qui ont déjà utilisé ce logiciel s'il vous plait,  [...] Comme j'ai 3 différents western ( mon Cruz marker = controle auquel je compare les densité de mes bandes ) a réagit différemment, d'habitude quand j'avais 2 différents western je prend toujours la plus haute densité de mon marqueur et je la divise par la plus baisse puis je calcule la densité adjustée de mes échantillons, comme j'ai 3 western différents je ne sais pas comment les adjuster.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western blot + extraction proteine

En ce qui concerne le volumen de lyse, je ne travaille pas en flasque, mais je lyse une boite de 6cm avec environ 1 à 2 millions de cellules, et ensuite je charge environ 15 à 25 µL ce qui correspond à 30000 ou 50000 cellules par puit. Mais après tout dépend de la protéine que vous voulez détecter.  [...] Oui le dosage dans le Laemli n'est pas possible en effet, mais il n'est pas forcément necessaire de doser les protéines. L'expérience du manipulateur ainsi qu'un contrôle adapté en western permettent d'obtenir un résultat impeccable (je ne fais que des western et j'ai arrêté de doser mes protéines assez rapidement).  [...]