• Forum - Concentration, Buffer, Protéines

[Immunologie] Western Blot analysis

La réalité est effectivement que certains anticorps ne reconnaissent plus leur cible en WB. Pour sauver la situation on peut tenter plusieurs choses. On peut par exemple faire ses gels à l'urée pour ne pas dénaturer les protéines de la même manière et essayer de préserver son épitope.  [...] Pour l'urée, quelle concentration utilises-tu pour ton gel Parce les buffer à urée 8M sont au moins aussi violents que le guanidium pour dénaturer les protéines.  [...]

Problème de migration SDS-PAGE

L'expérience consiste, dans un premier temps, à dénaturer les protéines dans de l'urée 8M + DTT 5mM, puis à les renaturer par l'utilisation d'un tampon (TrisHcl, NaCl et EDTA), une centrifugation est ensuite réalisée, le surnageant correpondant à ma fraction soluble est concentrée par evaporation et mon culot correspondant à ma fraction agrégée est resuspendu dans un peu de tampon de dénaturation (Urée 8M + DTT 5mM) et Laemmli Buffer 5X.  [...] il semble que j'ai résolu le problème qui n'était autre que l'urée... En effet je dénature avec de l'Urée 8M puis renature avec un tampon (TrisHCL, NaCL, EDTA) puis je concentre ma protéine par evaporation, l'urée reste donc à trés forte concentration à la fin de l'évaporation.  [...]

[Biochimie] électrophorèse SDS PAGE

Je travaille avec des protéines recombinantes. Avant j'avais des bandes extraordinaires et bien claires ms dernièrement la séparation ne se fait pas comme il faut et n'arrive pas au front de migration.  [...] Je fais la migration en volt fixé. Normalement je le fixe à 120V, parfois le courant reste fixé à 120v et le générateur affiche une tension de 50mA, dans ce cas j'obtiens de bons résultats et j'ai une très bonne séparation. Mais le problème qui se pose c'est que parfois le courant s'arrête à 60V et 70mA et dans ce cas j'obtiens une mauvaise séparation et la migration s'arrête au milieu du gel.   [...]

[Biologie Moléculaire] Tampon d'extraction

Si vous avez une solution de SDS 20% et qu'il vous faut une solution à concentration finale 2% il suffit de diluer 10 fois votre stock. Je ne vois pas bien le problème. Si vous ne faites pas comme cela il va vous falloir repeser les poudres à chaque fois (avec les variations que cela engendre), remettre tout cela en suspension (avec le temps que cela prend).  [...] Pas forcément pour le seul buffer de lyse d'ADN. On trouve du SDS dans les tampons pour l'analyse de l'ADN mais aussi pour l'analyse des protéines. Ca va être coton de faire un gel de polyacrylamide en pesant le SDS.  [...]

[Biochimie] conservation des protéines en milieu aqueux

Dans le cadre d'un TIPE, je réalise une expérience mettant en jeu des solutions eau-protéines (type albumine). J'aimerais être sûre que la concentration en albumine (initialement faible) de la solution soit toujours la même quelques heures plus tard, en sachant que l'eau utilisée est celle du robinet et que, par conséquent, elle contient des bactéries.  [...] Ok donc je vous conseille fortement de conserver vos protéines dans un tampon quelconque (buffer d'IP, de pull down, de purif, etc...) et de stocker tout ça à -20° ou à -80° voire même en faisant un flash freeze si vous en avez la possibilité, même pour quelques heures.  [...]

[Divers] Probleme western blot!!

Bonjour, depuis quelques temps j'ai un problème avec mes western, il n'y a pas de proteine de haut poids moléculaire. pourtant comme vous pouvez le voir il ne s'agit pas d'un problème de transfert car certain échantillon ainsi que le marqueur ont des proteines de haut poids.  [...] La c'était 75ug mais ca me le fait a 50 et 100ug de proteines. les échantillons n'ont pas était chauffé. Ils ont juste était préparé le jour précédent le western (lammly buffer ajouté) et congelé, gel préparé également le jour d'avant (mis au frigo dans su tampon d'éléctrophorèse).  [...]

[Biologie Cellulaire] Western blot + extraction proteine

Attention attention, le RIPA est un buffer principallement utilisé pour faire des IP. Si ce sont les protéines totales qui vous intéressent ce n'est pas une extraction en tant que telle qu'il faut faire, il vaut mieux lyser classiquement vos cellules dans du Laemli 1X avec béta-mercapto ou DTT.  [...] Vous allez surement dire que si sa marche pas en WB c'est probablement du à plein d'autres choses... mais sa vient pas techniquement du WB parceque la proteine je la detecte dans le milieu (aprés avoir concentré 40fois) des cellules c'est à dire avant la lyse mais dans le culot j'ai rien ce qui est pas normal.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expliquer le Blocking buffer

c'est plutôt sur les protéines endogènes que le bloquant se place. Simplement en se mettant un peu partout, là ou il y a interaction, mais de façon non spécifique.  [...] en immunohisto, je ne sais pas. Par contre, en western blot, on utilise un blocking buffer pour saturer la membrane. Ce buffer est souvent du lait ou de la BSA ou une sauce commerciale... Le principe est qu'il contient des protéines. Les anticorps étant eux même des protéines, ils pourraient se fixer non spécifiquement sur la membrane et faire du bruit de fond lors de la révélation.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

J'utilise une composition de gel tout ce qu'il y a de plus classique (10% acrylamide, 375 mM Tris 8.8, 0,1% SDS, 0,05% APS, Temed) pour le gel de séparation et (4% acrylamide, 125 mM Tris 6.8, 0,1% SDS, APS, Temed) pour le gel de concentration. Mon running buffer est un tris-glycine-sds mais je ne me rappelle pas de tête les concentrations.  [...] Certaines protéines notamment les plus grosses et les membranaires restaient alors piégées, elles restaient donc tout en haut du gel (dans le gel de concentration) et le WB était donc systématiquement négatif. Si tu es dans cette situation,tes échantillons doivent être fortement turbides et par ailleurs ils doivent extrêmement visqueux voire carrément pateux et le chargement doit être particulièrement difficile.  [...]

Question SDS-PAGE

Dans le cas d'une electrophorese non dénaturante, le facteur conformation risque d'interférer sur le facteur poids moléculaire, en ceci que, la conformation peut permettre une migration +/- facile de la proteine.  [...] Le Sample Buffer Reducteur, est en fait un tampon qui reduit les ponts disulfures (mercaptoethanol ou DTT) pour casser la structure III et IV des proteines.  [...]