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Plasmide recombinant

L'ampicilline est l'antibio classique qui permet de sélectioner les bactéries qui contiennent le plasmide quand tu les transformes (seuls poussent les bactos qui ont le plasmide). C'est l'étape de la contruction et de la sélection.  [...] cette sélection s'effectue en étalant les bactéries transféctées sur une boite d'agar contenant la Tet, toutes les colonies obtenues de cette façon contiennent un plasmide.ces colonies résistantes sont ensuites téstées pr leur capacité de croitre sur un milieu contenent l'Amp.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Mais le problème c'est que tu devrais avoir environ autant de colonies que dans les conditions pTetC, pM1 et pM2. Et donc sur ces boîtes parmi tes clones tu vas en avoir plein qui ne possèdent que le plasmide sans insert.  [...] ça ne me semble pas logique, car le plasmide ouvert ou non, s'il est présent dans la bactérie, permet de résister à l'ampicilline et permet donc aux colonies de se développer dans la boîte. Le gène de résistance de l'ampicilline n'étant pas localisé dans la zone de coupure.  [...]

Plasmide et gène LacZ

Ensuite pour différencier les transformant des non transformant, on utilise un autre gène de sélection, par exemple le gène LacZ (non présent ici) qui a la propriété de produire une substance bleue s'il est transcrit et traduit. Le gène luc étant inséré au milieu du gène LacZ, celui-ci ne peut être fonctionnel que dans le cas où le plasmide ne serait pas recombinant.  [...] Je pense qu'il y a une erreur parce que les bactéries non transformantes ont déjà été éliminées par l'action de l'antibiotique (Amp). Le système LacZ permet de différencier les bactéries (ou colonies) qui ont un plasmide avec l'insert (bactéries transformantes recombinantes) et celle qui ont le plasmide sans l'insert (bactéries transformantes non recombinantes) de part la couleur des colonies observées sur boîte de Pétri (si le milieu est préparé avec de l'IPTG et du XGal).  [...]

[Biologie Moléculaire] cellules compétentes DH5a

en vu de clonner un fragment de gene, jai commencé par préparer des cellules compétentes DH5a, par traitement avec la glace. 20min dans la glace suivies par des lavages avec le glycerol. Aprés la transformation par électroporation, j'ai trouvé des colonies sur la boite LB+Amp de controle négatif( cellules DH5a sans vecteur) sur les autres boites LB+ Amp+ IPTG+ X-Gal j'ai trouver des colonies blanches et des colonies bleu.  [...] Le fait d'avoir des colonies sur ta boite controle indique que soit tu t'es trompé et tu as mis du plasmide la ou il ne fallait pas. soit que tu as une legere contamination (ca depend aussi du nombre de colonies que tu as).  [...]

[Microbiologie] Les différents systèmes de comptage de colonies en boîte de Petri

je viens de commencer mon mémoire de fin d'etudes qui porte sur l'analyse et le comptage de colonies (bactéries) dans une boite de petri,et j'aimerais juste avoir quelques informations sur les différents systèmes ou méthodes de comptage de colonies en boite de petri, et lesquelles, svp.  [...] Le plus souvent, les colonies sont comptés sans outils. on peut utiliser un petit compteur sur lequel on appuie chaque fois qu'un compte une colonie (cela permet de se concentrer sur la boite et moins sur les nombres). Mieux, il existe des stylos électroniques qui comptent 1 chaque fois que l'on appuie avec sur la boite, au niveau d'une colonie.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- l'efficacité de transformation obtenue avec le produit de ligation. nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec insert et ligase.  [...] Si vous avez 10 000 colonies sur la boite expérimentales et 10 colonies sur la boite contrôle c'est bon. Vous piquez quelques colonies et vous savez que la majorité de vos clones contiendront l'insert. Si vous avec 10 000 et 8 000, vous savez que vos restrictions de plasmides ne sont pas efficaces et qu'il va vous falloir screener pas mal de colonies pour trouver vos petits. Prévoir un colony lift dans ces cas là.  [...]

[Génétique] Help! tp génétique, analyse clonage

On me demande de calculer la compétence des cellules. nombre de colonies/ microgrammes d'ADN. mais je ne vois pas trop d'où vient le plasmide pu en quoi cest un test de compétence.  [...] Ce que tu fais c'est que tu transformes tes colonies avec le plasmide natif (= non recombinant = sans insert). Tu veux vérifier que les cellules l'ont bien intégré donc tu les étales sur une boîte contenant du LB agar et... (un antibiotique, non ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

cela te permettra de visualiser directement (si colonies bleues et StreptR, pas de plasmide recombiné, si colonies blanches et StreptR, plasmide recombiné dedans).  [...] Le plasmide de départ est StreptoR et AmpR. Donc, si j'ai des colonies sur LB+strepto+amp, c'est que les bactéries ont intégré le plasmide natif.  [...]

Hybridations plasmides et sondes

je pense que tes plasmides étaient dans ta boite de pétri initiale dans laquelle il a aussi des bactéries sinon ca sert à rien et que ces plasmides étaient dans ces bactéries et que tu nous présente un protocole d'extraction d'ADN plasmidique.  [...] Cette manip te permet de visulaiser quelles colonies (et donc quels plasmides) contiennent ta sequence d'interet (tu auras un spot noir sur ta photo). Ensuite, il ne te reste plus qu'à recuperer les colonies identifiées sur ta deuxieme boite de petri (identique à ta membrane de nitrocellulose puisque replique), a les relancer en milieu liquide pour en extraire l'ADN plasmidique (manip 2).  [...]

[Divers] Bactéries

Pour faire le dénombrement de bactéries,on fait différentes dilutions de rapport 10 et ensuite on met cultiver ces solutions dans des boites de Pétri.Plus la dilution augmente, moins on aura de colonies sur la boite.  [...] Et je t'assure que diluer 10 5 fois n'est pas de trop... Si tu a quelques millions de bactéries dans ta culture de départ, il faut au moins diluer 10 5 fois pour avoir quelques colonies sur ta boîte (on m'a dit que le nombre devait être de 30 à 300 colonies sur une boîte pour que ce soit acceptable ).  [...]