• Forum - Colonies, ADN, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- bruit de fond dû à l'ADN non digéré ou digéré par une seule enzyme. nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec la ligase.  [...] Pour l'instant, nous n'avons aucun moyen de contrôler que nos colonies aient bien pris le vecteur + l'insert. C'est un tp en plusieurs séances, le tp de lundi prochain a pour but de vérifier le clonage en purifiant les ADN plasmidiques puis on fera des digestions enzymatiques contrôles.  [...]

[Biologie Moléculaire] pb de mutagenèse dirigée

je travaille avec un plasmide type pcDNA3 de 4.5 Kb dans lequel g mis l'ADNc du gène du facteur Willebrand (8.9 Kb). l'amorce que j'utilise fait 30 b avec 15 bases de chaque coté de la mutation et elle a été commandée sur le site recommandé par Stratagene, donc je pense pas qu'il y ait un problème à ce niveau.  [...] mon problème est que je n'obtient pas de colonies avec mon plasmide recombiné, les témoins de mutagenèse et de transformation sont OK, j'ai bien des colonies bleues et blanches. mais les bactéries traitées avec mon plasmide ne poussent pas sur le milieu de culture LB+ampicilline quelque soit la quantité d'ADN ou de solution bactérienne étallée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Sinon pour identifier les plasmides ayant un inser, pourquoi ne pas faire un crible de PCR sur colonies avec un oligo specifique de l'insert et un autre du plasmide ca marche tres bien et on est certain de la presence de l'insert (car la disparition d'une resistance par inactivation d'un gene peut aussi etre du a une mauvaise religation du plasmide sur lui meme.).  [...] Pourquoi ne pas faire une ou plusieurs mini prép d'ADN (en priquant une ou plusieurs colonies) et simplement faire une digestion suivie d'une migration sur gel d'agarose et voir si on insert est présent. Si oui repartir des bactéries qui ont intégré le bon plasmide avec insert et faire une maxi.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR : migration après amplification (sans digestion enzymatique)

Je dispose de deux colonies bactériennes une blanche et une bleue (ayant donc subi un criblage blanc-bleu) donc une ayant intégré l'insert au niveau du polylinker et l'autre non. Le plasmide originel faisait 3900 pb et l'insert 240. J'en déduis donc qu'une colonie blanche a un ADN de taille 3900+240 soit 4140 pb et une bleue de 3900 pb.  [...] Là je ne suis pas sure de moi du tout. est-ce que pour la colonie bleue il n'y a pas de produit d'amplification et pour la colo blanche il y en a un de 240 pb Je trouve ça illogique car la PCR amplifie l'ADN, or la colonie bleue même sans insert contient bien un plasmide donc de l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] compatibilité OriS et Ori de PMB1 dans un même plasmide?

J'ai obtenu des colonies de bactéries qui ont poussé avec ce plasmide. Ensuite j'ai prcoédé à des recombinaisons chez la levure et j'ai électroporé les YACs extraits de la levure dans des E. coli DH10bêta. Et là j'ai des résultats bizarres, je ne sais pas si je n'ai pas perdu l'insert, car j'avais des colonies positives (criblage pcr) et après une maxi prep, j'ai obtenu de bonnes quantités d'ADN mais plus de réponse par PCR.  [...] Un bonne chose serait peut être de linéariser ton plasmide pour au moins vérifier qu'il a la taille attendu. Quelques restrictions bien senties ne serait pas non plus du luxe.  [...]

[Génétique] Help! tp génétique, analyse clonage

On me demande de calculer la compétence des cellules. nombre de colonies/ microgrammes d'ADN. mais je ne vois pas trop d'où vient le plasmide pu en quoi cest un test de compétence.  [...] Ce que tu fais c'est que tu transformes tes colonies avec le plasmide natif (= non recombinant = sans insert). Tu veux vérifier que les cellules l'ont bien intégré donc tu les étales sur une boîte contenant du LB agar et... (un antibiotique, non ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Les colonies de bactéries contenant un plasmide recombinant se différencient des autres colonies bleues par leur couleur blanche.  [...] Donc pour moi T1 est un témoin pour montrer le nombre de colonies ayant intégré un plasmide.. Témoin de transformation c'est ça.  [...]

[Biologie Moléculaire] Hybridation d'une sonde nucléique plasmidique

Voila j'ai un petit probleme lors d'un TP sur l'hybridation d'une sonde nucléique plasmidique non radioactive sur colonies bactériennes on me demande la nature et le role des dépôts d'ADN génomique et ADN plasmidique.  [...] J'ai répondu que l'ADN plasmidique est le témoin négatif et l'ADN génomique le témoin positif car il contient la séquence cible mais je ne sais pas comment l'expliquer ni comment expliquer leur nature.  [...]

[Génétique] vecteur de plasmide

pétrie, le milieu de culture et l'antibiotique (très souvent de l'ampiciline). On obtiendra donc des colonies à certains endroit ce qui signifie qu'il y a une résistance à l'antibiotique maintenant, ce qui correspond au plasmides recombinants. En revanche, quand il n'y a pas de croissance, cela signifie qu'il s'agit de plasmides non-recombinant.  [...] - des colonies blanches ce qui signifie que tu as des bactéries qui ont intégré le plasmide et l'insert puisque l'insert se retrouve en plein milieu du gène lacZ, il est non fonctionnel donc pas de synthèse de B galactosidase et donc pas d'interaction avec le substrat chromogène (X-gal).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

Comment est-ce possible d'avoir des colonies blanches (qui restent blanches après +sieurs jours au frigo) et de ne pas avoir d'ADN plasmidique dedans.  [...] Ce qui me semble étrange, c'est que si l'ampicilline était vraiment inactif, j'aurai du obtenir beaucoup plus de colonies sur mes plaques de contrôles et de transformation (en moyenne 40 colonies obtenues). Mais j'ai vraiment du mal à comprendre comment c'est possible d'avoir les colonies blanches et de n'avoir aucun ADN plasmidique sur le gel ensuite.  [...]