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siRNA et pénétration / ARNsi

Pour generer des lignee stables exprimant des siRNA, il existe des systemes retroviraux (pSiren si je me rappelle bien). Je ne comprends pas bien ce que vient faire la lpenetratin dans ce cas. La penetratin peut etre utile pour faire entrer des peptides (tout comme le peptide fusogene de la proteine Tat de HIV) voire des proteines recombinantes dans des cellules.  [...] C'est aussi l'interet d'utiliser des retrovirus (ou autres virus si tes cellules ne se divisent pas) pour avoir une integration efficace (dans le cas des retro). Il n'en reste pas moins des problemes de niveaux d'expression variables qui necessitent un criblage de nombreux clones.  [...]

[Biologie Cellulaire] A quoi sert le co-transfert avec un vecteur de résistance à un antibiotique

Donc l'idée est de co transfecter les deux vecteurs, puis, dans les clones resistants (i.e. ayant intégré le vecteur de resistance), on va rechercher lesquels ont aussi intégré le vecteur contenant le cDNA. Dans ce cas, la probabilité d'intégration est encore plus faible (p²) (sur ce point je diffère de l'avis de fxmulder ).  [...] Pourquoi ne pas faire un stable qu'avec le vecteur codant les recepteurs et cultiver en dilution limite pour établir des clones à partir de cellules isolées sachant que la proba d'intégration est de moins de 1 sur 1 million, ce serait impossible de trouver rapidement un clone stable.  [...]

compter des cellules/marquer de l'ADN/transgenese

En revanche la levure (S. cerevisiae) fait au contraire 99% de recombinaison homologue ce qui est tres tres tres pratique pour cibler l'intégration.  [...] Pour résumer, la transgénèse se fait sur cellules ES par Rec. Hom., on sreen plusieurs centaines de clones (vérifie l'intégration par PCR) et on injecte l'embryon au stade de morulla, ensuite il faut prier pour que la lignée germinale soit touchée, sélectionner une descendance positive et refaire une croisement si nécessaire (s'il est hétérozygote).  [...]

[Biochimie] Méthode Cre-Lox : application ?

La procédure classique consiste à intégrer un site, cribler, puis sur les clones possédant un site Lox, réaliser la deuxième recombinaison avec le deuxième site Lox, cribler et sélectionner le (s) clone (s) qui possèdent les deux sites LoxP. Un séquençage permet de s'assurer de la position des sites, et on peut (doit) faire une PCR avec des amorces spécifiques des deux parties intégrées pour s'assurer qu'on n'a pas d'intégration de sites LoxP ailleurs dans le génome.  [...] Petite parenthèse à ce sujet, dans les séquences flanquantes modifiées qui vont s'intégrer à la région voulue, on ajoute assez loin des régions homologues le gène de la thymidine kinase. Sa présence dans les clones indique une intégration non spécifique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Décision de replication de l'ADN

Que ce soit pour la croissance embryonnaire (lol), ou encore pour les lymphocytes lors d'une esclandre contre les infections... Mais on peut aussi se demander pourquoi certaines cellules ne se divisent plus (exemple les synapes, pour leur soma, et autres...).  [...] Il se trouve que certains clones transformés de la sorte ont proliféré. les plasmides par lequels ils ont été transformés portent donc des séquences permettant la réplication des plasmides, sans intégration dans le génome.  [...]

[Biologie Cellulaire] Stabilité d'une transfection

Suite à une transfection réalisé grâce à de la lipofectamine j'ai une expression transitoire de mon gène d'intérêt, cependant pendant la phase de sélection avec le G418 de façons général toutes les cellules meurent et je ne peut pas récupéré de clone stables.  [...] parce que si tu fais une intégration dirigée tu peux linéariser ton plasmide et déphosphoryler. Je n'ai jamais utilisé cette technique avec la lipofectamine, les cellules sur lesquelles je travaille doivent être électroporées.  [...]

Vecteurs rétroviraux

NB. La différence se fait grammaticalement entre des cellules eucaryotes sous-entendant une liste non-exhaustive, et les cellules eucaryotes qui sous-entend l'inverse par comparaison / association.  [...] est faux puisqu'à l'infection (transformation) la capside se désagrège et libère son contenu dans le cytoplasme. Les virions issus de la réplication en attente de lyse ne transforment pas la cellule (transformation opérée par le provirus intégré auparavant à l'étape de l'infection).  [...]

[Biologie Cellulaire] Biolistique

voilà je travaille sur les méthodes d'intégration de siARN dans des cellules.  [...] Et j'ai juste une question sur la biolistique qui consiste à fixer ces ARN sur des petites billes de metal puis les bombarder sur la cellule pour incorporer les ARN dans la cellule.  [...]

[Biologie Moléculaire] Système d'extinction conditionnel de gène in vivo

Jusqu'à présent, le labo dans lequel je viens d'arriver se contentait du système Cre/Lox pour invalider le gène spécifiquement dans les cellules du rein chez la souris.  [...] Dans ces 2 cas, l'induction de knockdown est activée par l'injection de tétracycline. Cette technique semble demander plus de préparation que les siRNA mais semble plus efficace.   [...]

Maladie pour exposé

comment les rétrovirus orthoretrovirinae (sauf le lentivirus) peuvent par le procédé des rétrovirus (d'intégration de leur génome dans celui de la cellule hôte) entrainer des leucémies et divers cancers.  [...] J'ai rapidement regarder ce qui était à l'origine des cancers, en gros c'est les divisions anormales des cellules, et donc comment l'intégration du génome virale peut modifier cela (ou est-ce à cause d'autre chose que l'intégration du génome à cause de la synthèse des prot virales ).  [...]