• Forum - Clonage, Système, Gateway, Fragments, Vecteur

[Biochimie] Gateway technology

Je débute en clonage, et je vais utiliser le système Gateway. J'ai reçu d'un labo un entry vector et un destination vector. J'ai regardé un peu le système Gateway, et ce n'est pas clair pour moi.  [...] Je tombe sur cette discussion 3 ans après mais la je suis dans la meme situation. Avez vous pu réussir votre clonage En effet je dispose d'un système gateway et j'ai des fragments pcr que j'ai envie d'insérer dans mon vecteur d'entrée pENTR1A, mais la carte de ce vecteur est un peu ambigue pour moi.  [...]

Clonage avec Technologie Gateway

Je tente de réaliser un clonage avec la Technologie Gateway, je voudrais savoir si à partir de cette technologie on peut directement cloner des fragments amplifier par PCR et digérés par des enzymes spécifiques et les tranférés dans un vecteur d'entrée par ligation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage Gateway...intérêt ?

Pour l'intérêt de tes 2 plasmides. générallement, ton second vecteur est un vecteur d'expression et non le premier vecteur...le premier vecteur te permet par exemple de séquencer le gène introduit...même si par précaution certains séquencent aussi après insertion dans le second vecteur (comme dit avant, les deux séquences sont censées être identique car pas de polymérase intervenant, il y a uniquement une recombinaison...).  [...] ça revient au même qu'avec les enzymes pour l'insertion dans ton second vecteur sauf que là encore, tu n'a pas besoin de rédigérer ton fragment à partir de ton premier plasmide pour le mettre dans un plasmide d'expression. Ici, avec le système gateway, ton plasmide d'entré va directement servir à la recombinaison avec ton second plasmide.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

On commence par insérer le promoteur qu'on lie au vecteur grâce à une ligase (en supposant bien sûr que les deux extrémités soient compatibles), puis on insère le gène qu'on lie au promoteur et enfin on fait de même avec le terminateur.  [...] Reste à insérer l'ORF dans le vecteur. Cependant il éxiste beaucoup de méthodes de clonage (gateway etc).  [...]

Technique Gateway

J'ai vu la technique de clonage par Gateway, mais ce n'est pas clair du tout. Je ne vois pas l'intêret du passage d'un vecteur donneur, à un vecteur d'entrée, à un vecteur de destination et enfin d'expression.  [...] c'est un système plus efficace que l'ensemble enzyme de restriction + ligase pour faire passer un fragment de DNA d'un plasmide à un autre,  [...]

[Génétique] Tag du système Gateway

je suis en train d'apprendre le système Gateway et j'ai un souci avec les différents vecteurs de destination qu'on utilise. ils ont des Tags.. déjà je ne sais pas trop ce qu'est un Tag.. je ne vois pas à quoi ils vont servir par la suite comme. GST, 6*His, MBP ou TAB-Tag.  [...] Je ne vois pas pourquoi ce système de recombinaison est plus avantageux qu'un clonage normal.  [...]

[Biologie Moléculaire] Recombinaison LR et interférence ARN

Je sais bien comment ça se passe dans le cas classique, mais le problème là est que le vecteur de destination (en l'occurence pK7GWIWG2D (II), à vos souhaits ) contient deux cassettes Gateway indépendantes (attR1-ccdB-attR2) séparées par un intron. Le but est d'introduire deux fois la séquence du gène d'intérêt en tête-bêche.  [...] Je sais que la réaction LR se fait en une fois, mais je ne vois pas comment ça se passe. est-ce qu'il y a une réaction LR séparée au niveau de chaque cassette, avec deux vecteurs d'entrée.  [...]

[Microbiologie] transformation

je dois cloner les produits de digestion de la mutagenèse (insert ADN) dans le vecteur PGEX4T1 en transformant les bactéries compétentes DH5± J'ai trouvé des clones sur un milieu 2YT/AMP j'ai fait une miniprep pour extraire le plasmide recombinant simplement sur le gel les produits sont piégés dans le puits j'ai refait la manip à plusieurs reprises je trouve toujours le même résultat avec un smear Aidez moi que devrais je faire.  [...] ce que j'ai mis sur gel 0.7% est le produit de miniprep il s'agit d'un clonage classique ce qui m'étonne c'est que les produits sont toujours piégés dans le puits il n'y a rien en dessous juste un smear.  [...]

[Biologie Moléculaire] Fournisseur plasmide d'expression (avec ORF spécifique)

Il est si difficile que ça à faire ce clonage C'est quoi le souci Faire entrer le promoteur j'imagine vu que tu as déjà ton insert en gateway.  [...] Non ce n'est pas dificille en effet mais la technicienne qui fait les clonages n'a plus de bactos ccdB compétentes donc il faut en refaire, puis refaire du vecteur hôte, ajouté à cela d'autres problèmes, etc... Enfin bref c'est une accumulation de petits problèmes qui au final nous font perdre du temps et on ne peut plus trop se permettre d'attendre car le résultat de la manipe peut remettre le sujet en cause (d'où notre empressement).  [...]

[Biologie Moléculaire] Programme de clonage

Le module où il faut choisir les vecteur ENTRY/DEST est destiné aux vecteurs de type Gateway (Invitrogen). Ce n'est pas le cas des pET. Pour les vecteurs classiques, il faut utiliser le menu Build a Construct... (ou cliquer sur 'construct' dans la barre d'icônes).  [...] Apparemment, le menu est masqué sur votre système. J'ai un peu de mal à prévoir le comportement des PC sous windows je dois dire. Le Save as.. est disponible dans le menu Fichier. Le raccourci est toujours dispo (CTRL-MAJ-S), ainsi que le clic après ALT. Je crois qu'en général, les soft donnent moins d'option pour faire un Save As&.  [...]