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[Biologie Moléculaire] Transfection Huv-ec-c

Cela fait 4 semaines que je tente désespérément de transfecter des cellules Huv-ec-c (provenant d'ATCC, pas des cultures primaires) avec un plasmide pEGFP-N3 dans lequel est inseré l'ADNc codant pour ma protéine d'intérêt (et j'ai vérifié qu'il y était).  [...] De manière moins idiote, on peut aussi se dire que la transfection est OK mais que le plasmide n'exprime pas la GFP pour diverses raisons (exemple. La protéine de fusion modifie la conformation de la GFP et l'empeche de fluorescer...).  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique GST-Pull Down

Pour cela on clone dans un plasmide l'ADN codant pour la GST et l'ADN codant pour la protéine d'intérêt, de cette sorte les deux protéines sont fusionnées (elles sont accrochées l'une à l'autres).  [...] le pulldown après c'est parce qu'on utilise des billes couplées à des anticorps qui fixent la GST et sa protéine fusionnée, on peut laver puis éluer pour concentrer la protéine d'intérêt.  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent Clonage

Nous avons reçu un nouveau plasmide, je dois y faire exprimer une protéine. L'insert d'interet est exprimé dans un autre plasmide.  [...] La protéine que je veux exprimer doit avoir une GFP et un tag His, ces deux là sont déjà dans le nouveau plasmide, mai puisque je dois synthetiser mes amorces avec un codon stop, comment ces tags peuvent-ils etre lus.  [...]

[Biochimie] Protocole IMAC

J'ai effectué une transfection d'un plasmide PcDNA 3 contenant un insert codant pour une protéine recombinante possédant un Tag His (6 fois)en N-Terminal, dans des cellules adhérentes HEK-293 (eucaryote).  [...] Par la suite je compte réaliser un dessalage pour éliminer l'imidazole du tampon d'élution. Puis, la protéine sera conservée dans du PBS à 4°C.  [...]

[Biologie Cellulaire] Stabilité d'une transfection

Je transfecte des cellules rétroviral avec un plasmide adapté auquel j'ai intégré mon gène d'intérêt ainsi qu'un gène de résistance au G418.  [...] parce que si tu fais une intégration dirigée tu peux linéariser ton plasmide et déphosphoryler. Je n'ai jamais utilisé cette technique avec la lipofectamine, les cellules sur lesquelles je travaille doivent être électroporées.  [...]

[Biologie Cellulaire] Transformation levure par PCR

Je travail sur les levure et je souhaite les transformer afin qu'elles expriment ma protéine d'intérêt couplée à une protéine fluorescente. Pour cela j'utilise la technique. PCR based transformation method qui consiste à utiliser un plasmide (pRS306) qui contient la protéine fluo et faire une PCR avec des oligonucléotides codants pour les séquences de mon gènes que je veux marquer.  [...] Je comprend la théorie mais techniquement je ne vois pas du tout comment cela se produit, comment mon plasmide intègre mes séquences codantes Est ce que il faut digérer mon plasmide avant si vous avez des publi ou des revues qui explique ca en détail je vous en serais très reconnaissant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Dominant négatif

En fait, tu transfectes tes cellules (qui expriment la protéine sauvage à leur surface) avec un plasmide codant pour cette même protéine mais qui est mutée (souvent il y a une délétion de la partie intracellulaire du récepteur ce qui empêche la transduction de se faire).  [...] L'aspect de dominance n'a rien à voir avec la surexpression qui est un aspect purement technique (tout dépend du type de plasmide et donc du type de promoteur). A ce compte là dès que l'on surexprime un mutant c'est un dominant négatif... Le terme négatif vient au contraire du fait que ce type de mutant induit un phénotype muté à l'état hétérozygote (donc avec une quantité égale de protéines mutées et non mutées).  [...]

[Génétique] Transfection transitoire plasmide/siRNA

- que devient la protéine transfectée ici la GFP, les cellules filles sont-elles deux fois moins vertes ou un est verte et l'autre non, ou les cellules filles contiennent encore du plasmide qui s'exprime.  [...] - la disparition progressive de la fluorescence est-elle due à la dilution de la population ou à la dégradation du plasmide et de la protéine exprimée. quelle cinétique.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr comment commencer

Je suis cencer realiser une transfection pour obtenir la secretion d'une proteine par des cellules H4. Parallelement on me demande de realiser des primers correspondant a la sequence en acides nucleique de cette proteine donc.  [...] Enuite tu vas transfecter ton plasmide dans des cellules et si tout se passe bien tes cellules devraient produire ta protéine en question.  [...]

[Biologie végétale] Compréhension d'un article sur les OGMs

1) Dans le texte on parle en 2.2 et en 2.4 de deux construction de vecteurs, je ne vois pas à quoi sert le premier Expression and purification of recombinant Ta-JA1 protein in E.coli et pourquoi on utilise un vecteur en 2.4 et pas un plasmide Ti.  [...] 2) En 2.4 ils parlent de deux méthodes. Freeze-thaw et leaf disc. Le freeze thaw permet simplement de briser les cellules d' Agrobacterium tumefaciens pour que les vecteurs contenant le gène d'intérêt (qui remplaceraient donc le plasmide Ti ) entrent dans la cellule.  [...]