• Forum - Cellules, IP, Protéine

[Biologie Moléculaire] Immunoprécipitation

Je fais mes IP sur 1,5mg par échantillon (ma protéine n'étant pas trés abondante) donc environ 7 millions de celllules par puit lors du WB. Cela dit après avoir lysé mes cellules (tampon salin ou NP-40 pendant 30 min) je centrifuge le lysat et ne fait mon IP que sur le surnageant.  [...] La protéine d'intérêt est-elle taggée L'anticorps utilisé pour l'IP est -il dirigé contre une étiquette Avez-vous essayé un WB sur le culot de billes après IP en procédant à une étape de dénaturation pour être sûr de dissocier la protéine des billes (parfois des anticorps se lie très fortement, dans ce cas il faut peut-être changer d'anticorps pour rester dans des conditions natives, ou alors tester avec des concentrations salines plus importantes).  [...]

[Biologie Moléculaire] Lyse cellulaire

Je voudrais savoir s'il est possible de lyser des cellules pour récupérer par co-IP une protéine liée à un lipide. Parce que forcément la lyse cellulaire va entraîner une rupture des interaction lipides-protéines et donc du complexe que je cherche à récupérer.  [...] non, un crosslinker = un produit qui fait des liaisons covalentes entre tous les trucs qui passent à sa portée. C'est utilisé pour fixer des liaisons labiles le temps de purifier une interaction. Par exemple on l'utilise en ChIP pour fixer les protéines sur l'ADN, avant de lyser les cellules et de récupérer l'ADN lié aux protéines d'intérêt (formaldehyde par exemple).  [...]

[Biologie Cellulaire] Manip de co-IP??? what's wrong!!!

En fait, je crois qu'on peut incriminer tout (l'Ac, les billes le tag...), je voudrais juste attirer votre attention à un détail. C'est que j'ai réalisé dernièrement deux manip d'IP anti V5, la première avec la protéine A j'avais un lysat cellulaire totale (non transfecté par V5) et un autre transfecté V5, la deuxième manip d'IP réalisée avec la protéine G, idem.  [...] j'immunoprécipite et là je révèle la topo2 dans tous les culots d'IP même dans les cellules non transfectées V5 (je rappelle que l'Ac immunopricipitant et l'anti V5 qui tague ma protéine d'interêt). je suis resté bouche B, et je suis rentré chez moi pour dormir.  [...]

Visualisation d'une cellule apoptotique....

Tu peux effectivement suivre les cellules apoptotiques sans les trier avec l'annexine 5 et l'IP. Il suffit de regarder les cellules annexine5 positives IP negatives.  [...] Sinon certaines cellules apoptotiques presentent un marquage IP intermediaire entre negative et positive, c'est aussi a tester. Il suffit de rajouter a ta culture de l'IP sans permeabilisant.  [...]

Co-Immunoprecipitation

J'ai une question très naïve... Lors d'une co-immunoprecipitation, dans le lysat, on se retrouve avec une protéine A que l'on précipite qui est liée avec son partenaire B que l'on détecte en western blot. Cependant si dans les cellules/tissus lysés il y a une portion de A et de B qui ne sont pas liés ensemble, est ce que le complexe A-B peut se former après lyse des tissus (dans mon tube) En conséquence, est ce qu'une co-immunoprécipitation peut être quantitative c'est à dire est ce que dans deux coditions expérimentales on peut dire si la portion de complexe A-B augmente par rapport aux forme A et B libres.  [...] En effet, le volume utilisé de lyse/d'IP est très largement supérieur au volume de cellules initial, et en conséquence, la concentration en protéine A et B est largement inférieure dans le lysat que dans la cellule, ce qui déplace l'équilibre du côté de la dissociation.  [...]

Interaction cellule/virus

Ou sinon tu construits une protéine de fusion GST/glycoprotéine virale et tu fais un pull down classique sur un un lysat membranaire des cellules sensibles pour voir si tu descends bien ton récepteur cellulaire... T'as pas forcément besoin d'une interaction avec la cellule entière...non.  [...] SI ta protéine est bien un partenaire de gB et qu'elle est présente en quantité correcte à la surface des cellules, il n'y a aucune chance que le virus se décroche de ta cellule. Le virus ne porte pas une, mais plusieurs dizaines ou centaines de gB, dont un grand nombre vont se lier à cette protéine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot : quelle unité ?

Sinon, je suppose qu'ils font une IP anti-His pour ne regarder l'ubiquitination que de leur protéine taggée. De très nombreuses protéines sont ubiquitinées dans la cellule, un blot anti-Ub donnerait donc un profil général n'apportant rien.  [...] Je le regarderais plus tard. Malgré que ce western ne soit pas beau, il est tout de même interprétable. la protéine est ubiquitinée au bout de 20 minutes et cette ubiquitination perdure au cours du temps, ce qui veut dire, si ces temps sont sur cellules, que l'ubiquitination en question n'est pas de type à adresser au protéasome (K48) et que l'ubiquitination est stable (non réversée par des déubiquitinases).  [...]

[Biologie Cellulaire] poly-ADP-ribosylation de protéines

j'étudie les modifications post-traductionnelles d'une protéine exprimée dans les cellules HeLa. Je n'ai pas vu de phosphorylation de la protéine immunoprécipitatée. Je voudrais voir maintenant si elle est poly-ADP-Ribosylée mais je ne dispose pas d'anticorps anti-PAR.  [...] Comment souhaites-tu inhiber les PARP Inhibiteur ou siRNA Dans ce cas, une condition sans inhibiteur/siRNA et une avec inhibiteur/siRNA avec IP anti-ta protéine et western blot anti-PAR et la démonstration sera correcte, je trouve, au niveau fonctionnel. Peut-être que dans les publications cela leur suffit comme manip, mais il serait plus rassurant d'ajouter un marquage métabolique et/ou une spectrométrie de masse dans la mesure du possible (collaboration avec une plate-forme ou un labo intéressé...).  [...]

[Biochimie] Problème de détection en co-ip

On cherche à obtenir une co-ip de 2 protéines transmembranaires (cellules eucaryotes) sachant que l'une d'elle a besoin d'être dénaturée et l'autre ne doit pas l'être.  [...] Conséquence, soit on ne chauffe pas du tout et on ne décroche pas les protéines des billes, soit on chauffe pour éluer et du coup on dénature notre protéine 1 qui du coup ne peut plus migrer sur notre gel.  [...]

Technique

dans le GST, il faut un tag GST, donc une protéine de fusion. Dans l'IP, pas besoin de protéine de fusion, on peut le faire sur une protéine native, mais il faut un anticorps spécifique.  [...] De la, on peut dire que le GST est universel mais nécessite de faire une protéine de fusion, alors que l'IP on peut la faire en conditions physiologiques, mais il faut un anticorps spécifique qui fonctionne. etc.  [...]