• Forum - Base, Site, Restriction

[Biologie Moléculaire] Sites de restrictions proches sur vecteur

Merci IngDr pour ce lien super. J'étais allé sur le site de NEB mais visiblement je n'avais pas assez fouillé...Je vois que les deux enzymes que je veux utiliser clivent à 97% un fragment où une seule base est présente après le site de restriction...donc j'ose espérer que sans base, il y aura suffisamment de coupure.  [...] Les enzymes de restrictions sont des endonucléases. Il faut donc nécessairement au moins une base avant le site de restriction. En principe c'est quand même bien d'avoir 5 ou 6 bases pour que l'enzyme puisse bien s'orienter sur le site de restriction. Cela dit le tableau de IngDr donne que la restriction est faisable dans tes conditions. Essaie.  [...]

Besoin que l'on eclaire ma lanterne en Génetique

La RAPD est une technique de PCR permettant d'obtenir une empreinte spécifique à partir d'un génome donné. On utilise pour cela des amorces ayant une faible spécificité (elle s'accrochent à de multiples endroits de l'ADN). Comme tous les génomes sont différents, les sites de fixation des amorces seront variables d'un individu à l'autre.  [...] Je connais moins bien l'AFLP, mais il me semble que c'est la technique utilisée pour les empreintes ADN humaines (par exemple en criminologie). Elle se base sur la restriction du génome, c'est à dire coupure par des enzymes de restriction. On utilise des enzymes ayant un site de restriction assez rare.  [...]

[Génétique] site de restriction HinfI

D'apres mes recherches( Le résultat trouvé selon le site de restriction mapping. http.//www.restrictionmapper.org/cgi-bin/sitefind3.pl ), la digestion donne 2 fragments de 176 et 22, par contre dans tous les articles ils trouvent deux fragments de 175 et 23, soit un décalage d'une base.  [...] je trouve aussi une coupure a 22. Mais en même temps il y a un overhang de 3 bases, ça explique peut etre la différence. C'est si important.  [...]

[L1 BIO] TP Biologie moléculaire

Si oui j'ai un petit problème,avec notre électrophorèse on a ajouter un ladder ( une gamme étalon pour visualiser la taille de nos fragments ) si la carte de restriction est bien donné par l'électro je visualise que mon deuxième site de coupure Xho1 se trouve entre 800 et 1000 paires de bases.  [...] Du coup je comprend vraiment pas.Le gène total de la GFP fait 717 paires de bases,si le deuxième site de restriction Xho1 était à mettre dans sa totalité il serait à 947 paires de bases,ce qui collerait plus au niveau de la visualisation par electro,mais du coup j'aurais un problème pour recalculer la taille totale du plasmide recombinant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction VS fragment d'ADN

Je pense que deux paires de bases c'est peut-être insuffisant pour permettre la digestion. j'avais l'ahabitude de mettre 4 à 5 base en amont de mon site de restriction, donnant un design d'amorce de ce genre.  [...] Bonjour, j'aurais une question de novice sur les enzymes de restriction. En quoi le fait d'être un site palindromique du style ATAT rend une séquence vulnérable aux enzymes de restriction.  [...]

Carte de restriction

Idem avec le plasmide B pour générer les 3 fragments, en supposant qu'on utilise la même enzyme de restriction pour les 2 plasmides Où se situe le site de restriction surnuméraire et à quoi cela correspond-il concernant la mutation.  [...] La réponse se trouve dans l'explication juste au dessus. Essayez de réfléchir en quoi le changement d'une base dans le plasmide pourrait créer un nouveau site de restriction surnuméraire.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

Tout a fait, si tu as une carte de restriction tu peux couper a la base pres. Il faut juste avoir un site bien placé. Comme ça tu peux supprimer la fin de ton ADNc et le rabouter a ton autre gène, sous réserve de sites de restrictions bien placés sur l'un et l'autre des fragments et qui permettent un assemblage en phase.  [...] Je ne sais pas quel vecteur tu veux utiliser, mais il existe des centaines de vecteurs commerciaux qui comportent tout ce qu'il faut, dont un MCS ( multi cloning site ) entre le promoteur et le terminateur. Ce site contient une grande quantité de sites de restriction et permet d'insérer facilement ce que tu veux. (voir image).  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage petit fragment d'ADN

A la fin du catalogue NEB ou sur leur site, il donne le nombre de nucléotides qu'il faut avoir entre le bord et le site de restriction pour que la digestion se fasse de manière correcte.  [...] Le produit PCR est effectué à l'aide d'amorces dont le site de restriction a été rajouté avec 3 nucléotides en amont. Celui-ci a été purifié à l'aide d'un kit de purification de produit PCR sans passer par une extraction sur gel car j'ai un produit bien spécifique.  [...]

Southern blot et séquençage - Interprétation

Et on remarque que la mutation (transversion) qui a transformé le A en C, a fait apparaitre le site de restriction de l'enzyme (CTCGAG) chez l'individu 2.  [...] J'ai également besoin d'aide sur cet exercice, pourquoi avoir utilisé le brin matrice pour apres repérer le site de coupure de l'enzyme de restriction, n'est il pas possible de le faire avec le brin neosynthétiser.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai une petite idée qui vaudra ce qu'elle vaudra. Pour enlever ta cassette de résistance, as-tu pensé à amplifier ton vecteur par PCR en prenant des amorces qui excluent la cassette de résistance (et qui incluent en 5' de tes amorces les sites de restriction plus quelques bases en 5' de chaque site de restriction pour pouvoir les cliver par la suite) Si ton vecteur provient de bactéries, il sera méthylé.  [...] L'amplification par PCR va donner des amplicons non méthylés (et aussi ne contenant plus ta cassette vu que l'amplification du vecteur exclura la cassette). Tu ajoutes à ton produit de PCR l'enzyme DpnI qui va cliver l'ADN méthylé en fragments de quelques centaines de bases (enzyme de restriction reconnaissant un site de 4 bases méthylé).  [...]