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Techniques utilisées en lab de biomol - Page 2

Sur un gel de polyacrylamide coloré au bleu de Coomassie, est-ce qu'on peut déduire d'une bande à x kDa. tiens, cette bande à x kDa est présente partout. ça tombe bien, ça veut dire que la protéine Y, qui a justement ce poids moléculaire, est présente dans toutes les conditions.  [...] C'était pour détecter d'éventuelles différences dans les protéines du cerveau entre des souris mutante et WT. Effectivement, on a bien observé toute une région où les bandes étaient plus claires voire absentes (= une famille d'isoformes absents, finalement).  [...]

Expression de protéines

Dans les protéines issues des fractions solubles j'ai une taille plus grande que dans celles des corps d'inclusion (fractions insolubles).  [...] Si tu es certain que les deux bandes correspondent à ta protéine (la mass spec est de loin la méthode la plus fiable, bien plus qu'un WB), tu as probablement eu une protéolyse spontanée. Il faudrait savoir si ta bande de plus haut poids correspond à la masse attendue pour ta protéine, auquel cas tu aurais de la protéine intacte en fraction soluble et de la protéine clivée en fraction insoluble.  [...]

[Biologie Cellulaire] Co-Immunoprécipitation

Pour la partie 1) soit tu possedes un Ac specifique de ta proteine, dans ce cas tu fais une immunoprecipitation, ie que ton Ac va reconnaitre ta proteine, et que tu vas ensuite purifier ton Ac par diverse methode (je ne connais pas la methode du sucre) generalement tu utilises des billes (agarose/magnetique) couplees a des proteines A/G qui vont fixer les Ac.  [...] 6. Tu déposes sur gel et fait un Western Blot. Tu révèles avec un anticorps dirigé contre ta protéine B (alors que l'IP a été faite avec un anticorps contre la protéine A). Si tu as une bande au poids attendu pour B, cela signifie que tu as co immunoprécipité B avec A.  [...]

[Biochimie] Sds page

Donc si on fait un SDS PAGE avec le dimère, avec l'action de l'urée on n'aura qu'une seule bande (40 KDa par exemple) et avec l'action de l'urée et du mercaptoéthanol (qui coupe les protéines), on aura toujours une seule bande mais à poids moléculaire plus bas (style 20 Kda (20*2 = 40), puisque tu as un dimère, les 2 sous-unités ont bien le même poids et donc les chaines vont se retrouver au même niveau sur le gel et ne laisser qu'une bande.).  [...] Si tu as un dimère (ou tetramère ou tout ce que tu veux) avec des chaines à poids moléculaires différents, avec l'action de l'urée tu auras toujours une seule bande (puisque la protéine n'est pas clivée) mais avec l'action du mercapto éthanol, tu auras autant de bande que de sous unités avec un poids différents.  [...]

[Biochimie] Question Western Blot et Coomassie

Lorsque j'observe mon gel coloré au bleu de C. je vois bien de nombreuses bandes. Nous avons déposé deux conditions différentes. Et dans l'une d'elle j'observe une bande aux environs de 15kDa (ce qui correspond au poids de la protéine qui nous intéresse) qui n'est pas présente dans l'autre condition.  [...] Jusque là pas de souci, en revanche, après transfert et révélation (Ac primaire et secondaire contre ma protéine). La bande s'observe cette fois aux environ de 10-11 kDa.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

Dans un deuxième temps j'ai produit un anticorps reconnaissant cette protéine et j'ai fait un western avec l'anticorps purifié. J'observe alors une bande au bon poids et d'autres plus petites (ne fait pas une smire, il n'y a que 3 bandes de plus).  [...] En plus en écrivant cette réponse je me rend compte que quand je passerais au SiRNA, si je vois les autres bandes disparaitre en même temps que celle au bon poids alors j'aurais une partie de ma réponse, à savoir est ce du non-spé ou bien ma protéine.  [...]

[Génétique] Retard sur gel

En gros les retards sur gel sont assez chiant a interpreter, c'est pour ca que tu dois faire une piste d'ADN sans proteine, et differentes concentration de ta proteine. Sinon tu ne peux pas conclure grand chose.  [...] de méme pour le 2 éme complexe, si la bande à un poids moléculaires plus élevé, est ce que c'est car le complexe protéique B est plus lourd ou bien que sur cette bande il ya aussi le complexe protéique A attaché.  [...]

[Identification] Identification d'une protéine sérique

J'ai pu identifier sur le gel plusieurs protéines sériques. J'ai pu identifier l'albumine sérique et donc aussi les immunoglobulines, qui migrent comme prévu moins loin que l'albumine. Cependant, j'ai observé qu'une bande avait migré plus loin que l'albumine, cela signifie qu'elle de taille plus faible que l'albumine qui est de 65 kDa.  [...] Je te conseille de refaire migrer les échantillons avec le marqueur de poids moléculaires. On peut aussi envisager qu'il s'agisse de protéines non sériques (problèmes de purification), d'éventuels précurseurs ou bien au contraire de produits de dégradation de protéines sériques.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification Protéines Tag 6His

1) Les protéines se fixent mal aux billes de nickel donnant un rendement très faible, je retrouve la majorité de la protéine dans le surnageant, malgré 4 heures d'incubation. Il est possible qu'elles aient perdu leur Tag, je vais vérifier avec un anticorps cet après midi, mais si tel est le cas à quoi cela peut-il être du.  [...] N'aurais tu pas une modification post traductionnelle de ta protéine ou un clivage d'une region leader par expl Car il est peu probable que ta protéine courte existe dans ton eluat vu les différences d'intensité des bandes et que la bande de bas poid n'est pas du tout visible, alors qu'elle represente quasiement toute les proteines apres élution.  [...]

[Biologie Cellulaire] Contrôler la pureté des protéines

C'est très pratique pour isoler spécifiquement une protéine car sur une électrophorèse SDS PAGE classique, seule la masse moléculaire est discriminante donc lorsque tu fais une coloration de ta membrane en rouge ponceau, tu observes une multitude de bandes et chaque bande correspond à de nombreuses protéines différentes.  [...] Cependant il est écrit que les auteurs ont produits les protéines. C'est bien que l'on ne parle pas de protéines endogènes. D'où l'intérêt de produire ça dans un lysat de réticulocytes et de faire un gel shift pour tester la capacité des prot à interagir (puisque c'est sur ce point que la demande insistait).  [...]