• Forum - ARN, Lavages, éthanol

[Biochimie] L'acétone à froid dans l'extraction de l'ARN

Oui effectivement je confirme que l'utilisation de l'acétone est fait pour la précipitation des protéines, c'est vraie qu'on utilise généralement l'éthanol pour la précipitation des protéines, maintenant la précipitation à l'acétone est aussi plus efficace car, contrairement à l'éthanol, très peu de protéines sont solubles dans l'acétone.  [...] Si mes souvenirs sont bons, une fois qu'on a une interface claire après les lavages au phénol, on met de l'acétone avec notre solution d'ARN, on la laisse au froid toute la nuit puis on centrifuge longtemps à forte vitesse pour précipiter l'ARN. On obtient alors un culot qui ne contient que l'ARN q'on sèche alors par 1 ou 2 lavages à l'éthanol.  [...]

[Génétique] Principe de l'extraction d'ARN???

L'ADN et les prot résiduelles sont éliminées par les lavages (RW1 et RPE). L'éthanol du tampon permet aussi d'éluer selectivement l'ADN afin de n'obtenir que l'ARN au final.  [...] Pour simplifier les ARN sont retenus essentiellement par des laisons hydrogènes. La silice réagit plus ou moins selon la teneur en eau du milieu (d'où l'utilisation d'éthanol). Pour réactiver une silice on la charge en eau d'où l'élution finale de l'ARN dans l'eau qui la libère de l'ARN en remplaçant les liaisons H silice-ARN par des liaions H silice-eau.  [...]

[Biologie Moléculaire] Micro ARN

J'ai déjà travaillé sur du plasma en voulant extraire l'ARNt circulant avec du Trizol invitrogen et mes rapports de DO à 280 et sutout 230 n'étaient pas fameux. J'ai même utilisé plusieurs méthodes (TRizol + KIT, TRizol + précipitation, avec des lavages supplémentaires et l'utilisation de différents carreers) c'était pas encore ça.  [...] -20°C. D'autre part, je lavais ensuite avec de l'éthanol 75° et non 70. Enfin je laissais sécher 15-30 min mais pas plus par peur de mal redissoudre le culot. Je pense refaire des essais en changeant ces petites choses. Je crois également que sur du tissu, les rendements sont meilleurs que sur du plasma.  [...]

Extraction ADN phenol : température de centri

Je vais tester car pour le projet en cours j'ai des 260/280 moyens et des 260/230 carrément pourris (. 1 au Nanodrop.) et je cherche ce que je pourrais améliorer (en dehors d'ajouter des étapes de phénol-chlo puis chloroforme supplémentaires).   [...] ps. je fais homogénéisation dans du TE - lyse enzymatique (prot K-SDS) puis mécanique avec phénol/chlo pH8- un second phénol/chlo puis un chloroforme -RNase- précipitation à l'éthanol absolu - lavages -resuspension dans l'eau.  [...]

[Biologie Moléculaire] un protocole fiable pou extraire l'ADN

je fais des extraction d'ADN à partir de sang humain atteint par le VIH,j'ai pas réussi a avoir un protocole convenable surtout pour la lyse des globules blancs.j'aimerais bien avoir une technique convenable et surtout fiable parce que mes ADN sont fragmentés et de mauvaise qualité(avec le détail des quantités de chaque réactif dans chaque solution ou bien simplement avoir la gentillesse de m'envoyer des sites ou des liens qui peuvent m'aider)merci infiniment.   [...] sinon je commence normalement par la lyse des globules rouges plusieurs lavages( solution.Tris,MgCl2,NaCl)et puis celle des blancs par (Tris HCl,EDTA,Nacl, et SDS..proteinase K...aprés éthanol absolu.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ARN

Je viens de m'inscrire sur ce forum qui m'a l'air tout à fait intéressant. Ma question est la suivante. en fait je travaille actuellement sur des algues brunes et je réalise pas mal d'extraction d'ARN avec le kit Picopure RNA Isolation de chez Arcturus. Mais le problème c'est que l'ARN est souvent assez sale à la fin, donc je voudrai savoir si quelqu'un a déjà utilisé le Kit Rneasy Micro de chez Qiagen sur les plantes, et si vos résultats étaient meilleurs ou pas (car il possède un cleanup en plus). Merci d'avance et bonne journée.  [...] Seule précaution, une étape d'élimination de l'ADN génomique (contaminant potentiel) par DNAse directement sur la colonne d'extraction des ARN totaux entre les 2 lavages avant l'élution. (je ne sais pas si je suis très claire). Ensuite RT, puis PCR-Q (SYBR-Green / GeneAmp System 9600 / Applied Biosystem).  [...]

[Identification] IPG strip gel combiner a une extraction au PBS

Une personne dans le labo l'a deja essayer et son gel apres coloration etait... vide, aucun spot (sauf un mais bon...), il a ensuite essayer en utilisant un kit de lavage de l'extrait proteique mais le resultat obtenu etait moin bon qu'une extraction PBS suivie d'une 1-D en tube gel.  [...] L'extraction classique utilise un tampon phosphate pour le broyage initial, je doute que cela soit ca du fait des lavages, ensuite les proteines sont precipites avec du TCA, laver avec de l'ethanol et remis en solution avec un tampon dont je n'ai pas la composition sous le coude (je suis en stage donc je ne connais pas encore toute les solutions exactement).  [...]

[Microbiologie] Viabilité d'une bactérie et ARN

D'un autre coté si tu as isolé des ARN polyA+, tu as du te debarasser des inhibiteurs durant les lavages, dans ce cas la ca ne posera pas de probleme (dans le cas contraire tu pourras verifier que ton RNAse est active en verifiant que les ARNr sont bien dégradés.).  [...] Phénol/chlo. je vais perdre de mes ARN, la chaleur. je pense pas que les ARN apprécient, l'EDTA. sans cations je pense que ma RT va avoir du mal…….  [...]

[Biologie Moléculaire] Solution Q du kit Qiagen

- Ensuite tu transfères ce surnageant sur la colonne de filtration. à l'aide de centrifugation et de différents lavages avec différents tampons (RPE, RW1) tu filtres ton surnageant. Les ARN restent accrocher sur la colonne.  [...] Concernant le rôle exact des tampons utilisés dans les lavages, je ne peux pas trop t'en dire plus. Qiagen, c'est vrai, restant très secret sur la formulation de leurs produits.  [...]

[Biochimie] Différence entre tween, triton x, NP ... ?

Ca élimine l'excedant et ensuite tu peux raccourcir les autres lavages. Ainsi tu peux, en gardant le premier exemple de 3x 20 mins, remplacer par lavage rapide, 4 x 10 mins.  [...] Merci beaucoup de m'avoir éclairé sur les lavages. Je vais tester ces quelques manips dès maintenant. En fait j'utilise généralement de la BSA pour bloquer avec des lavages au PBS tween 20 0.1%. Je vais donc essayer les autres combinaisons buffer/detergent et changer les temps de lavages et nombres.  [...]