• Forum - ARN, Cellules, Séparation, Puits

[Biologie Moléculaire] Quantité d'ARN pour PCRq

J'aurais aimé savoir quel est la quantité requise en ARN pour faire de la PCRq. J'imagine que ca dépend de la sensibilité de la machine, mais c'est juste pour avoir un ordre d'idée car comme je fais la microextraction savoir si je suis vraiment loin du compte ou si ma microextraction suffit et évitera de pooler des échantillons.  [...] Dans mon labo je fais de la RT-PCRq à partir de cellules souches hématopoïétiques de souris après un tri par cytométrie. Le plus petit que j'ai fait pour le moment. extraction d'ARN et RT sur 400 cellules puis séparation en 4 puits de PCRq soit l'ARN de 100 cellules environ par puit et ca marche au poil.  [...]

[Biologie Moléculaire] Que devient l'ARNr dans une reaction de RT

Chaque puits contient un micro réseau dans lequel il y a le gel de séparation qui va être en contact avec une électrode, cette électrode sera soumise à un haut voltage qui va séparé tes ARN sur le Gel en fonction de leur taille. Quand les ARN passent dans le gels ils se lient au dye et à la fin du micro réseau la fluo sera detectée par la machine et tu vas obtenir un graphe avec les fluo et le temps de rétention sur le gel.  [...] Donc retour à la case départ, mes ARNs sont dégradés et j'ignore toujours pourquoi vu que je ne les détruits pas. En plus je mets de la RNase OUt qui inhibe justement les RNase...à 42°C pendant 1h mes ARN sont censés être encore en bon états etant donné que je les utilises comme matrice de ma rétrotranscription...je sèche.  [...]

Comptage de cellules dans des puits

J'ai un petit problème lié à un comptage de cellules dans des puits. pour faire simple, dans un puits de 3000 cellules, certaines sont colorés en bleu et d'autres non.  [...] En effet, pour moi, il faudrait que pour les quatre régions choisi du puits on compte les cellules coloré en bleu et celles non bleu pour pouvoir faire un proportion sur l'ensemble du puits permettant de trouver le nombre de cellules colorer sur les 3000.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème test MTT et différenciation

Mon protocole est le suivant. dans une plaque 96 puits incubé 24h pour les cellules HepG2 et 48h pour les cellules SK-N-BE(2) à l'avance (à une concentration de 60 000 cellules/puits), je retire le milieu complet (avec SVF) de mes puits puis je dépose le traitement (molécule diluée dans du milieu incomplet.  [...] Cependant les cellules ne sont plus très belles à la fin de la différenciation, mais j'observe cependant des changements morphologiques. Et elles ont également tendance à se répartir au centre du puits, je pense que c'est pour cela qu'elles ont du mal à survivre.  [...]

[Biologie Moléculaire] micro damier à adn

b) Le puits est vert. L'ARNm n'est exprimé que dans les cellules saines. Le gène correspondant est donc inhibé (voir absent s'il apparait par mutation) dans la cellule cancéreuse.  [...] d) Le puits est noir. L'ARNm n'est exprimé dans aucun des deux types cellulaires. Attention néanmoins, aucun puits n'est jamais tout à fait noir. Il existe toujours une faible réponse qu'on appelle bruit de fond. Les seuls puits d'intérêts sont ceux dont l'intensité dépasse ce bruit de fond.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème culture cellulaire HEK293 en plaque 96 puits

Je travaille actuellement avec des HEK293 que j'ai repiquées en plaque 96 puits dans le but de faire un MTS. 24h après le repiquage (~10000 cellules/puits), mes cellules apparaissent adhérentes, belles et bien éparpillées dans le puits mais peu confluentes (20% grand max).  [...] On dirait que mes cellules se sont décrochées lors du changement de milieu pour s'agglomérer sur les bords... J'avoue que j'ai du mal à comprendre surtout que j'ai été assez délicat pour éviter de décrocher les cellules (tips au fond du puits, coincé sur le bord, et aspiration du milieu doucement à la pipette puis dépôt du nouveau milieu en plaçant le tip sur la face interne du puits).  [...]

[Biologie Moléculaire] les puces à ADN

b) Le puits est vert. L'ARNm n'est exprimé que dans les cellules saines. Le gène correspondant est donc inhibé (voir absent car il n'est pas apparu par mutation) dans la cellule cancéreuse.  [...] c) Le puits est rouge. L'ARNm n'est exprimé que dans les cellules cancéreuses. Le gène correspondant y est donc activé (alors qu'il était inhibé dans la cellule saine, voir absent si il n'y a pas eu mutation).  [...]

[Biologie Cellulaire] co-culture les cellules vont-elles interagirent??

Moi je veux que sa reste le plus stable possible pour qu'effectivement comme le dit piwi les cellules sédimentent le plus vite possible et en grand nombre. Du coup si j'agite même lentement le milieu je ne favorise pas vraiment la sédimentation des cellules.  [...] Par contre j'avais pensé à centrifuger légèrement la plaque 6 puits pour faire tomber les cellules transitionnelles au fond et favoriser la rencontre avec les cellules stromales. Cependant j'ai peur qu'au début et à la fin de la centrifugation mon milieu ne s'échappe des puits...Qu'en pensez-vous.  [...]

[Biologie Moléculaire] les ARNs et extraction

En fait le protocole est fait de manière classique. Extraction au chloroforme d'environ 5 millions de cellules. récupération de la phase aqueuse, centrifugation et lavage et précipitation a l'éthanol. on redissoud le culot dans 10 µL d'eau. on a un rapport de pureté a peu près de 1.  [...] Pour commencer la séparation s'est faîte avec du chloroforme seulement. Le phénol n'était pas indispensable puisque l'on utilisait de la guanidine (couleur rose) + NaCl à pH basique. A ce pH l'ADN est + affine pour la phase inferieur (rose) et la phase supérieur contient l'ARN.  [...]

Lignée Jurkat et adhérence

Lors d'un tp, j'ai utilisée des cellules de la lignée Jurkat qui ont été cultivés dans du RPMI-1640 supplémenté avec du SVF. Par observation microscopique j'ai vue que ces cellules étaient adhérentes or elles sont normalement non-adhérentes. Je pense que cela peut venir de la nature de cette lignée mais je ne serai pas vraiment l'expliquer.  [...] Après, ces cellules ont était cultivée dans une plaque 24 puits à une concentration de 0.5e6 cellules/mL et lorsque j'ai fait cette observation (24h après), la concentration était de 1.4e6 cellules/mL.  [...]