• Forum - ARN, Cellules, Lavage

[Biologie Moléculaire] extraction ARN

Le problème c'est que mon extraction avec le Tripure à un rendement faible et ensuite ma PCR ne donne pas de résultats. Enfait le signal de mon blanc est plus élevé que pour mes cellules péritonéales. Je pense peut-être à la présence d'un inhibiteur.  [...] Vous faites l'extraction d'ARN de cellules de lavage péritonéal ou de tissu.  [...]

[Biotechnologie] Tampon de lyse

Ce tampon intervient directement après le lavage des cellules (bactéries ou cellules humaines), et à pour rôle de les détruire. Suivant ce que l'on veut faire ensuite (extraction protéines, ADN et/ou ARN), la composition du tampon varie, mais il contiendra généralement un détergeant afin de briser la membrane cellulaire et d'autre composants, également variables, mais aussi des sels et un pouvoir tampon au pH désirée.  [...] Bref, la composition du tampon de lyse est (très) variable suivant la manip' que l'on réalise, mais son rôle est généralement d'extraire notre produit en détruisant la cellule.  [...]

[Biologie Moléculaire] ARN insoluble ??

les ARN de cellules non transfectées se resuspendent bien. Le problème c'est que pour transformer des hépatocytes, c'est la seule solution. Mais le PEI a été évacué en changeant le milieu, et il y a eu un lavage avant extraction.  [...] Ba si ton PEI reste à l'intérieur de tes cellules, il est libéré lors de la lyse, et pour une raison ou pour une autre reste attaché à tes RNA (surtout si il les précipite) ca pourrait être à peu près plausible.  [...]

RT PCR quantitative

Dans les 2 cas, je te conseille de préparer soigneusement des ARN ADN-free = après extraction de tes ARN, tu les traites à la DNase. J'utilisais le kit RNeasy de Qiagen (colones) en faisant le traitement à la DNAse (Qiagen) directement sur la colonne pendant l'étape de lavage des ARN.  [...] Comme ça la DNase est eliminée au lavage. Après l'élution tu as des ARN tous propres, sans DNase (problématique pour l'étape de PCR suivante.) et sans ADN génomique qui te donnerait des résultats faussement positifs et sur-estimés.  [...]

Méthode ELISPOT !

. Quand je fait le lavage de cellules,,,,, les cellules qui sont attaché au ligands sont relargé est les liaisons sont cassé,, et en faite ce qui reste sur ma boite serais des ligands avec les protéines secréte par ces cellules,,, dans ce cas,, je pourais voir si muc1 était impliqué ou pas,, en utlisant des Anticorps,,,,  [...] Donc questions,,,, le lavage,,, est-ce quil casse les liaisons entre les cellules et les ligands,,, ou au final y'auras un nombre de cellules collé dans ma boite.  [...]

real time pcr

J'utilise le kit RNeasy de Qiagen (colones) en faisant le traitement à la DNAse (Qiagen) directement sur la colonne pendant l'étape de lavage des ARN. Comme ça la DNase est eliminée au lavage. Après l'élution tu as des ARN tous propres, sans DNase (problématique pour l'étape de PCR suivante.  [...] Bon, maintenant j'ai refais des RTqPCRs hier et j'avais oublié un truc. Dans le kit qiagen que j'utilise pour mes RTs il y a une phase dite G-wipe qui dégrade l'ADN génomique. Comme ca, la question est réglée, je fais comme vous (seulement avec ces merveilleux kit maudits de chez qiagen, on ne sait même plus ce que l'on fait tellement c'est simple.).   [...]

[Biologie Cellulaire] Mesure de l'activité d'exocytose de la HRP chez l'amibe (Niveau L2)

Lors d'un TP de biologie cellulaire nous avons mesuré l'activité d'ENDOCYTOSE de la HRP par l'amibe en faisant un suivi spectrométrique de la HRP des cellules d'amibe préalablement lavés, centrifugés, lysés en y ajoutant le substrat de la HRP. le TMB.  [...] Ton protocole est tout à fait juste. Peut-être une petite étape de lavage à 4°C avant de les suspendres dans ton tampon d'exocytose afin d'éliminer des HRP qui serait associées de manière non spécifique aux cellules. (Et à 4°C pour bloquer l'exocytose afin de ne pas démarrer l'exocytose avant le lavage).  [...]

[Biologie Moléculaire] Nettoyage d'ARNs & Transfert de protéines

1) J'ai des ARNs que je voudrait nettoyer. La DO 260/280 est bonne (. 2) mais je suis apparemment contaminé par les sels du tampon RLT (extraction sur colonne) puisque ma DO 260/230 n'est que de 1,3. Est-ce que vous pensez que ça peut poser un problème pour les envoyer en Q-RT-PCR Et si oui, pour éliminer ces sels, est-ce qu'une simple précipitation à l'isopropanol (+lavages à l'EtOH) suffirait.  [...] Concernant les ARN, tu peux laisser les tampons de lavage infiltrer la colonne pendant 5-10 min avant de centrifuger (le RPE en particulier).  [...]

[Biologie Cellulaire] isolation des mitochondries

Merci Greg pour le détail du protocole. Dès que mes petites cellules auront décidées de se laisser transfecter je le testerai... J'ai hate de voir si ca a fonctionné.  [...] Dans mon protocole, pour l'étape 2 (après s'être débarassé du premier culot contenant les débris cellulaires et noyaux), ils centrifugent à 15000g pdt 5min. Tu récupères ainsi les mitochondries, les peroxysomes et les lysosomes. Ensuite, à toi de jouer pour isoler les mitochondries en utilisant par exemple un marquage immunofluorescent.  [...]

[Biologie Moléculaire] Difficultés pour solubiliser de l'arn

Suite à une extraction d'ARN totaux à partir de larves de Trichinella (nématode) j'ai des difficultés pour ressolubiliser mon ARN. Mon protocole est basé sur une extraction classique au phénol-chloroforme et à la fin un lavage à l'éthanol 75% et séchage. Le séchage de mon culot s'est fait en étuve à +37°C puis resupension dans de l'eau Rnases free.  [...] En fait j'ai réussi à ressolubiliser une partie de mon culot en refaisant une extraction phénol-chlo. Néanmoins, il me reste une partie insoluble. Pensez-vous que pour faire ma banque d'ADNc je devrais refaire une extraction où je peux travailler avec mon culot dissout En gros, j'ai peur que ne se sont dissoutes que certaines catégories d'ARN, lesquelles je ne sais pas mais c'est possible.  [...]