• Forum - Anticorps, Protéines, Intérêt

[Biologie Moléculaire] Techniques de transfert

La technique utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour séparer les protéines, préalablement dénaturées, selon leur masse. Les protéines sont ensuite transférées depuis le gel sur une membrane (typiquement en nitrocellulose), où elles sont exposées à un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt.  [...] Il est possible grâce à cette technique de détecter la présence d'une protéine dans un tissu, d'évaluer sa taille, sa concentration, les variations de cette concentration, effectuer des comparaisons de concentrations entre différents groupes, etc.  [...]

[Biologie Cellulaire] Expression des protéines

1. Quand les cellules commencent à exprimer les protéines dans un milieu de culture ( surtout les protéines mitochondriales et celles de la matrice extracellulaire pour les myotubes, lignée C2C12 ) je crois après 48h mais je voudrai confirmer cette infromation.  [...] En fait ce que je pense à faire est. une inhibition exogène par un anticorps dans un premier lieu et une induction exogène par une protéine recombinante pour voir les variations de mes protéines d'intérêt ( mitochondriales + MEC).  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction protéines pariétales

Dans le but de faire un western-blot avec un anticorps (polyclonal) je me lance dans des extractions de protéines. Seulement (pas de bol) ma protéine d'intéret est ancrée dans le peptidoglycane de ma bestiole de façon covalente (motif LPXTG). Pour info je bosse sur une bactérie G+ qui a la mauvaise idée de résister au lysozyme.  [...] Sinon euh... je sais que moi j'extrait mes protéines par variation du pH en connaissant le pHi de mes molécules d'intéret (ph9 en récupérant le surnageant puis précipitation à pH 4,5 mais je ne sais pas si ça pourrait t'être utile).  [...]

[Biologie Cellulaire] Co-Immunoprécipitation

5. Tu rajoutes un tampon dénaturant (SDS et b-mercaptoethanol), qui va dissocier et dénaturer les anticorps, libérant ainsi les protéines A et B.  [...] Tu peux aussi immunoprécipiter avec un anticorps anti C (autre protéine connu pour ne pas interagir avec A ni B), et vérifier la présence de A ou B. Si tu détectes A ou B, cela signifie que tu as une fixation aspecifique de ta protéine sur les billes, que tes lavages n'étaient pas bons.  [...]

[Biologie Cellulaire] Notion de contrôles, contrôles isotypiques, culture cellulaire

Pour moi, il s'agit d'un contrôle permettant la vérification de l'absence de fixation non spécifique d'un anticorps, que l'on effectue en incubant une IgG dirigée contre une protéine jamais exprimée dans la cellule qui nous intéresse. Ainsi, on vérifie l'absence de fixation non spécifique et donc la spécificité du marquage effectué avec l'anticorps dirigé contre la protéine que l'on veut localiser.  [...] Bah si l'anticorps qui cible votre protéine d'intérêt est un IgM, l'anticorps contrôle doit être un IgM. Si il s'agit d'un IgG, le contrôle doit être un IgG.  [...]

Co-immunoprécipitation: à quoi sert le flowthrough?

Bonjour, j'ai récemment effectué un stage où j'ai fais une co-immunoprécipitation avec des billes magnétiques, sur des cellules lysées. Avant d'éluer les complexes billes -anticorps-antigènes, on a placé les tubes sur le support aimanté pour récupérer le surnageant que mon maître de stage a appelé flow through.  [...] Le flow through est censé ne contenir que les autres protéines cellulaires dont je n'ai pas besoin Si la co-pi a fonctionné je ne devrais rien avoir dessus au WB (ou montrerait les restes de protéines d'intérêt n'ayant pas lié) Cela sert à savoir si la liaison entre l'anticorps et la protéine est bonne ou mauvaise.  [...]

[Biochimie] Différence entre tween, triton x, NP ... ?

Voilà, je voudrai utiliser un detergent non ioniques (le moins dénaturant possible pour mes protéines) pour diminuer les adsorptions non specifiques d'anticorps ou autre protéines d'interet sur un test qui se rappoche de l'ELISA.  [...] Courament pour des manip avec des protéines on utilise du PBS-tween 20 0.05%-0.1% ou du PBS-triton X100 0.1% (note que tu peux remplacer le PBS par du TBS (Tris buffer salin), des fois ca peut aider). En théorie on peut utiliser un blockage au régilait ou à la BSA.  [...]

Immunoblot

Et pour le western, on détecte les protéines avec un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, cet anticorps lui-même porteur d'une activité détectable (fluorescence, activité enzymatique, radioactivité).  [...] Le western blot consiste en une migration des protéines dénaturées au beta mercaptoethanol et SDS dans un gel de polyacrylamide+SDS (détergent qui va dénaturer les protéines et les charger), un transfert sur membrane et une révélation grâce à des anticorps marqués.  [...]

[Biochimie] etude de proteine de liaison à l'ADN

A priori je dirai immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), dont le principe consisite à fixer la séquence d'ADN à laquelle tu t'intéresse sur des billes d'une colonne de chromato, puis à faire passer dans cette colonne les protéines dont tu suspectes la liaison à la séquence considérée. Après élution, tu récupères la protéines liée.  [...] Selon les cas, tu peux vérifier quelle protéine interagit avec ton ADN en ajoutant a ton mix ADN+ protéines un anticorps dirigé contre ta protéine d'intéret. Dans ce cas deux solutions.  [...]

[Biologie Moléculaire] Retard sur gel

En fait on s'assure de la nature de la protéine d'intérêt en étudiant les effets d'un anticorps dirigé contre cette protéine. (dans le cas bien sûr où on a des candidats).  [...] En effet, si le retard qu'on observe est bien spécifique a la protéine d'intérêt, l'incubation avec un anticorps dirigé contre peut avoir deux effets. soit le retard est décalé vers le haut (supershift) du a la taille du complexe, soit le retard disparaît, a cause de l'encombrement produit par l'anticorps dans l'interaction avec la sonde.  [...]