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[Biologie Moléculaire] RT-qrt-PCR : courbe de fusion et autres contrôles

Qu'est-ce que cela changerait qu'il y en ait eu. une plus faible probabilité de fixation des amorces sur l'ADN à amplifier, donc une diminution de la vitesse d'amplification, donc une mauvaise estimation de la quantité d'ADN initiale.  [...] Le principe, c'est que la vitesse d'amplification du produit (en phase expo) varie dans le même sens que la quantité d'ADNc présent dans l'échantillon. en quoi cela m'indique quel est le problème des dimères de primers et le rôle des différentes dilutions.  [...]

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En fait, l'étape de purification de l'ADN n'est plus obligatoire, surtout que l'on travaille avec des quantités infimes d'ADN. Le problème de ne pas purifier, c'est que les protéines de la cellule peuvent venir perturber la réaction PCR. D'où l'étape de purification de l'ADN, afin d'enlever un maximum de protéines.  [...] Cependant, plus la quantité d'ADN de départ est faible, plus il faudra de cycle d'amplification (et donc de temps).  [...]

PCR et RT-PCR

Pour la différence entre PCR et PCR quantitative, la différence, c'est la quantification de ton ADN produit, par spectrométrie par exemple.  [...] Dans la PCR quantitative, on va quantifier la quantité d'ADN présent dans un échantillon X en comparant l'intensité de la fluorescence émise par l'échantillon pendant l'amplification aux intensités d'une gamme d'ADN dont on connaît les quantités, amplifiés en parallèle.  [...]

[Génétique] Polymerase chain reaction

Aussi, j ai appris que la PCR en temps reel permet de quantifier precisement un fragment d adn d'interet present initiallement dans un echantillon, je ne comprend pas comment (Je comprends que cette technique permet de voir le nombre d'adn en temps reel mais comment obtenir la quantite initiale).  [...] Pour la qPCR, lorsqu'on est en phase d'amplification, c'est à dire avant de saturer le système, la quantité d'ADN néosynthétisée par la réaction est proportionnelle à la quantité initiale (plus il y en a au début, plus on en amplifie, plus on le détecte tôt).  [...]

[Biologie Moléculaire] Séquençage problématique

Je fais mes PCR sans problèmes, amplification de la bonne zone, quantité d'ADN (quantifié au nanodrop correct), mais les résultats me posent quelques problèmes. J'obtiens bel et bien ma séquence d'intérêt. MAIS.  [...] Si aprés vérification tu ne trouves pas le polymorphisme et en plus il affecte l'acide aminée correspondant et bien on pourrait commencer à penser à une mutation génétique (mais peu probable dans ton cas puisque à la base tu ne recherche pas de mut).   [...]

[Génétique] désignaion d'amorces pour une qpcr

Des amorces dégénérées pour une qPCR Non. Sinon l'efficacité d'amplification dépendra majoritairement de la probabilité d'hybridation de tes amorces et non plus de la quantité d'ADN.  [...] dans la mesure où l'efficacité ne serait pas comparable selon la cible amplifiée, oui. Et attention, une amorce dégénérée est d'autant moins spécifique, c'est à vérifier.   [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

Après extraction de mes bandes d'ADN obtenu sur gel, j'ai réalisée une purification avec le kit nucléoSpin Extract II de Macherey Nagel. Ensuite j'ai vérifiée sur gel que je n'avais pas perdu trop en quantité d'ADN pour la ligation. J'ai donc effectué la ligation sur vecteur de clonage pGEMT-easy de Promega en laissant une nuit à 4°C puis T°ambiante.  [...] J'ai travaillé sur E.coli DH5a, et je me souviens que si par miracle elle poussait après ligation+transformation, après une amplification, j'avais de très faible quantité d'ADN. Donc la bactérie est peut être aussi pourrite pour ce genre de chose.  [...]

sonde chaude et electrophorèse

Alors je vais pas dire gd chose de peur de dire des betises, mais l'electrophorèse ça consiste à faire migrer des fragments d'ADN sr un gel. Pr les résultats, en fait c'est comme si tu passais du sable dans des passoires dt la maille est de + en + petite. les + petits fragments vont le plus loin.  [...] Je pense qu'il faut aussi que tu recherches des infos sr la PCR (technique d'amplification de l'ADN) parce qu'on en fait svt avt l'électrophorèse pr avoir le fragment en quantité suffisante pour qu'il soit visible.  [...]

[Biologie Moléculaire] quantitative/real time PCR quelle différence?

La PCR compétitive est basée sur la co-amplification de la matrice d'ADN cible et d'une quantités données d'un ADN standard interne (compétiteur ) portant les mêmes sites de fixation d'amorces.  [...] Oui, à condition d'etre en phase exponentielle d'amplification. Ex. dans mes PCRq, a partir de 35 cycles environ, il y a un plateau, et la quantité d'ADN est identique dans tous les points et indépendante de la quantité initiale. Impossible de quantifier en fin de PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

La PCR en temps-réel permet de déterminer la quantité initial de matrice. En cela, elle est quantitative et on l'appelle parfois comme cela. Pour le principe, il existe des tas d'autres sujets, des cours, des schémas partout sur le forum et sur internet.  [...] La PCR en temps réel est une PCR où on suit l'amplification d'ADN en temps réel, point. Le fait de déterminer la quantité intiale n'est qu'un bonus, une possibilité qu'elle offre mais qui n'est pas obligatoire.  [...]