• Forum - Amplification, Classique, Séquençage, Séquence

[Biologie Moléculaire] Pcr-sbt

Le séquençage des gènes est amplifie par PCR. Le SBT, de la PCR-SBT (Sequence-Based Typing), permet l'identification précise de tous les nucléotides de la région d'ADN amplifiée.  [...] Concernant la PCR-SBT, j'en ai rarement entendu parler. Le peu que je sais a été dit par Heloradana. c'est une méthode d'amplification classique qui permet en plus un séquençage de la séquence nucléotidique.  [...]

Séquençage de l'ADN

Ah, si on ne connait rien de la séquence, c'est différent. On peut par exemple la cloner dans un vecteur connu et l'utiliser comme matrice de séquençage, mais on peut aussi utiliser des amorces aléatoires. Qu'il y ait un overlap n'est pas un problème si on a suffisamment de lecture. Renseigne toi sur le shotgun sequencing.  [...] Contrairement a la PCR classique, qui utilise un couple d'amorces (qui du coup borne la zone amplifiée), on n'utilise qu'une seule amorce en séquençage. Du coup, à chaque cycle, l'amplification démarre depuis cette amorce et sur un seul des deux brins, il peut y avoir n'importe quel autre ADN qui traine, il ne sera pas amplifié tant qu'il ne comporte pas la séquence de l'amorce.  [...]

PCR et autres

Quelle est la différence entre un PCR de séquençage et un PCR extension d'amorce Quand bien même y'en aurait-il une... car j'ai l'impression que c'est la même chose... merci de vos réponses .  [...] La première étape est la même (sauf qu'en séquençage tu vas utiliser des nucléotides fluorescents). Ensuite pour une PCR classique le brin amplifié lors du premier cycle sert de matrice à la seconde amplification. Du coup il y a une augmentation exponentielle, alors qu'en séquençage c'est linéaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Séquençage et métabarcoding

Soit il y a une seule plante dans l'échantillon. après amplification par PCR, vient le séquençage. J'ai vu qu'il existait plusieurs types de séquençage. pyroséquençage, séquençage par synthèse,... qui diffèrent par le nombre de fragments obtenus, la longueur des fragments, le taux d'erreur, le coût d'analyse par séquence.  [...] Cela signifie que, en ne connaissant pas notre échantillon, les amorces vont quand même matcher (puisqu'universelle) et permettre une amplification. Le but étant de séquencer la zone d'intérêt (avec les même amorces). L'identification de l'espèce se fait après le séquençage, non pas selon la longueur du fragment amplifié, mais bien selon sa séquence.  [...]

[Biologie Moléculaire] ADNc simple, double brins et PCR

Je ne comprends pas bien ton blocage étant donné que tu sembles avoir compris le principe de la PCR. ADN simple brin ou double brin, cela ne change presque rien pour la PCR, hormis le fait que la première amplification aura lieu sur une seule séquence d'ADN, alors qu'avec de l'ADN double brin on en a deux.  [...] une séquence d'ADN et sa séquence complémentaire. A partir de la deuxième amplification, on a deux séquences d'ADN qui sont amplifiées, on est alors dans le schéma classique de la PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Race_pcr

J'ai cloné une séquence partielle d'ADNc et confirmé par un séquençage celle-ci. Par contre ma séuence d'ARNm qui a été cloné en ADNc n'était pas complète, il me manque la fin de la séquence donc l'extrémité 3'. Quel sont les étapes d'un protocole RACE (rapid amplification of cDNA Ends) me permettant d'identifier cette partie manquante.  [...] MERCI beaucoup, malgré ma faute de frappe j'ai réussit avec vos explications et une amie à découvrir mon erreur.   [...]

[Génétique] principe des études moléculaires

J' ai également une seconde question... pour réaliser une PCR il faut une amorce et suite à l'amplification réalisée le séquençage est possible ainsi les mutations peuvent-elles être découvertes...mais pour l' analyse d'une maladie génétique portant sur une séquence d'ADN à déterminer comment fait-on Le séquençage n'étant pas possible par manque de matériel génétique puisque aucune PCR est réalisable sans amorce donc brin complémentaire.  [...] Je vais essayer d'amorcer le problème, quelqu'un pourra toujours me compléter ensuite. En effet pour connaitre avec précision une mutation, on peut réaliser une PCR avec des amorces encadrant la région considérée, puis faire un séquençage. Toutefois, le séquençage n'est pas absolument nécessaire et beaucoup d'autres techniques permettent de détecter une mutation en s'en passant.  [...]

[Biotechnologie] Race PCR

On fait ce qu'on veut. Ici c'est rapid amplification of cDNA end, donc c'est uniquement cela qui est explicité. Généralement, le but est de déterminer la séquence 5' inconnue d'un ADNc (et de là de l'ARNm dont il provient). Donc ensuite on peut prendre le produit de la PCR que j'ai rapidement expliquée ci-dessus comme matrice, la queue poly-dT comme amorce, les 4 dNTP plus 4 ddNTP puis faire un séquençage de Sanger.  [...] Le +1 de transcription se détermine plutôt avec la technique d'extension d'amorce, moins lourde que la 5'-RACE (je suppose), mais j'ai complètement oubliée la fin de cette expérience là (je crois que c'est par séquençage de l'extension la plus longue...pas sûr du tout).  [...]

[Biologie Moléculaire] séquençage ADN

Sinon ta PCR est intégrée dans un plasmide pour le séquencage ou tu séquences directement ton produit de PCR Si elle est dans un plasmide tu peux essayer de séquencer avec Pu et RP (présent dans tous les plasmides classiques d'amplification type TA cloning tel que le pDrive de qiagen) ou avec T7 qui est aussi presque toujours présent.  [...] je suis d'accord avec Piwi, cloner le fragment a sequencer permet souvent de simplifier le séquençage. Maintenant je ne crois pas trop a la degradation du primer pour expliquer ton absence de sequence. en effet un primer degradé donne surtout un mélange de séquence, ce qui fait qu'il y a du signal mais c'est totalement illisible.  [...]

comment cloner une enzyme extraite d'une cellule animale?

Alors si tu as l'ARN tu fait une rtPCR et tu réutilise ton ADNc en PCR puis tu le met dans un plasmide et zou direct dans une bactérie (type. E.coli DH5alpha). Si tu n'as que l'enzyme sous forme protéique alors rajoute une étape de séquençage de ton enzyme et de création de l'oligo correspondant (mais c'est la galère...).  [...] Et bien tu peux soit partir sur du séquençage par la dégradation d'Edmann (qui ne te donnera au moins le fragment N terminal, suffisant pour designer une amorce pour amplification du cDNA), soit tu as du séquençage par masse (séquençage direct et/ou avec digestion).  [...]