• Forum - Amorces, Séquence, Sonde

[Biologie Moléculaire] Design de sonde Taqman à partir d'une sonde FISH

Quoi qu'il arrive il te faut des amorces de part et d'autre de la sonde pour la qPCR. Réutiliser la séquence de la sonde FISH pour une qPCR en Taqman, c'est une bonne idée, d'autant qu'elle est publiée. Donc oui il te faut faire un blast et aligner les séquences spp.  [...] mais uniquement pour designer les amorces vu que tu as ta séquence pour la sonde taqman. Ensuite, pour une PCR classique, tu reprends les amorces de ta qPCR et c'est parti.  [...]

[Biologie Moléculaire] RT PCR plusieurs transcrits, un seul couple d'amorces?

Je te suggère de travailler avec la séquence du gène codant pour la protéine, tu prends la séquence nucléotidique alors, c'est mieux que de travailler avec une séquence protéique. si tu as plusieurs plusieurs séquences nucléotidiques du gène codant pour ta protéine, l'idéal est de faire un alignement multiple de ces séquences, et ressortir une séquence consensus (la région 100% identique), à partir de cette nouvelle séquence, tu pourra faire ton design d'amorces.  [...] Du coup il faut que tu aligne tous les transcrits et que tu design tes amorces et ta sonde (si c'est en Taqman) à partir de la séquence consensus.  [...]

Random priming

Mais si l'on utilises des amorces d'oligonucléotides dont les séquences sont aléatoires, comment sais-t-on que lesdites amorces vont venir s'hybrider à la séquence du gène recherché.  [...] Pour les sondes de Southern blot, elles ne s'hybrident pas à une séquence inconnue mais belle et bien connue. On amplifie par PCR la sonde avec des amorces connues sur une matrice connue et on la purifie. Ensuite, avec des amorces aléatoires, on utilise cet amplicon comme matrice en présence de dNTPs marqués.  [...]

[Biologie Moléculaire] signal southern blot

Es tu sur que la séquence de ta sonde est bonne J'ai déjà eu des surprises en commandant des amorces ou sonde. Mauvais copier coller, oubli, etc. Les causes d'erreur sont nombreuses.  [...] Ma séquence devrait etre la bonne, je l'ai faite synthétisée de nombreuse fois depuis que j'ai des soucis, je ne pense pas qu'une erreur ce soit repétée a chaque foi.  [...]

[Biologie Moléculaire] amorce PCR

Ton amorce sens est ATTGC, et pour trouver l'amorce antisens, tu compte que le fragment total fasse 70bp, tu te retrouve avec la séquence CGATA, et donc la sonde antisens correspondante est TATCG.  [...] je tenais aussi à vous remercier pour le temps que vous prenez a me repondre, ca peut paraitre rien mais je suis a quelque semaine de l'examen et je pensais ne jamais reussir a lire les amorces antisens avec une sequence mais la ca me semble(un peu) moins compliqué merci.  [...]

[Biologie Moléculaire] Question sur le design de sondes Taqman pour la PCR en temps réel

Lors du design de sondes Taqman avec un quencher BHQ, on part du principe que le Tm de la sonde doit être de 7-10°C de plus que celui des amorces, afin de s'assurer la spécificité de l'hybridation de la sonde.  [...] J'aimerais transposer une sonde MGB en sonde BHQ. Elle possède une taille suffisante pour une sonde BHQ (20nt), mais son Tm se situe entre ceux des deux amorces. Il y a la possibilité de rallonger la sonde pour augmenter son Tm, mais est-ce vraiment nécessaire.  [...]

[Microbiologie] Hybridation Southern Blot

et la sonde specifique a ce gene,comment je la choisie.. une sequence complèmentaire a la sequence de gene(que je cherche) ses specificitè.  [...] On remet tout ce petit monde en solution, on élimine avec des sondes (micro-array ou autre technique) les séquences qu'on connait et qui correspondent à des protéines ne nous intéressant pas, et s'il reste encore quelque chose, on le séquence.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème d'amplification positive avec de l'eau en q-PCR!

Les amorces on été designées en trouvant le peu de différences entre les deux séquences et ne peuvent pas trop être modifiées.  [...] J'ai moins d'expérience en Taqman mais on ne peut pas voir le Tm des produits malgré la présence de la sonde En fonction de là ou elle est placée par rapport aux amorces (je me suis jamais posé la question...). Ou déposer sur gel.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sonde pour un Northern Blot

Mon problème se pose donc pour le choix de la sonde, je pense utiliser la séquence consensus originale mais la question que je me pose est de savoir si je pourrais quand même avoir une hybridation entre cette sonde et les différents transcrits malgré les diverses mutations et indels.  [...] Sinon il y a une taille optimale pour la sonde ou on peut prendre la taille qu'on veut Je pense prendre la séquence entière de mon gène ancestral, soit 1 kb, comme sonde.  [...]

[Biologie Moléculaire] qPCR

cette question m'intéresse aussi. Et une autre qui va avec, peut être pourrez vous m'éclairer. si on veut que la PCR soit spécifique d'un microorganisme, il faut que les amorces soient spécifique. quelle est la méthode utilisée pour déterminer la séquence à amplifier.  [...] L'étape de synthèse des amorces en vu d'un Q-PCR est très importante, c'est d'elles que découle la spécificité de ton amplicon (produit de Q-PCR). Je sais qu'il existe un logiciel qui s'appelle PrimerPremier auquel tu peux recourir en complément il faut utiliser le site PubMed pour avoir la séquence de ton gène et un site disponible gratuitement sur les site de la compagnie Roche.  [...]