• Forum - Amorces, Enzymes, Restriction

[Biologie Moléculaire] choix des amorces

en fait, je suis face à une séquence d'ADN, pour laquelle on me demande d'établir le profil des amorces que je peux utiliser sans pour autant me donner les enzymes de restriction qu'on peut utiliser.  [...] Il faut éviter surtout les séquences formant des structures secondaires (genre des tiges boucles). Enfin il faut faire attention a ce que les deux amorces choisies ne s'apparient pas entre elles, ni ailleurs dans le génome/plasmide (donc eviter les longues répétitions monotones de A, ou de C, ou de G, ou de T).  [...]

Un particulier peut il se procurer du materiel de laboratoire ?

Pour les produits. Des amorces, des ADN polymérases, du NaCl2, des enzymes de restriction ecoR1, des ligases ect.  [...] Suivre bêtement un tutoriel qui ne fonctionne pas la plupart du temps Parce que la biologie moléculaire ça s'apprend pas sur YouTube. Enfin la théorie peut être, mais l'expérience montre que SURTOUT en biologie moléculaire, la théorie et la pratique n'ont strictement rien à voir entre elles*.   [...]

[Biologie Moléculaire] Aflp

ma question est.comment on peut faire une amplification selective des fragments de restrictionj'ai lue que la selection est faite parapport à une base mais jai pas bien compris.  [...] Je dirais. avec des amorces correspondant aux sites de restriction des enzymes utilisées pour découper l'ADN de départ.  [...]

[Génétique] AFLP Amplified Fragment-Length Polymorphism

J'essaye de comprendre cette technique (AFLP) et d'après ce que j'ai lu. l'ADN génomique est digéré par deux enzymes. Des adaptateurs sont ajoutés aux extrémités des sites de restriction. Les amorces peuvent ensuite se fixer sur les fragments obtenus et ceux-ci sont amplifiés.  [...] La PCR peut être réalisée en plusieurs étapes. une première avec des amorces dont la séquence est identique à celle des adaptateurs et qui amplifie ainsi tous les fragments. la seconde avec des amorces possédant de 1 à 3 nucléotides supplémentaires en 3' sélectionnant ainsi un plus petit nombre de fragments étant donné que ceux ci peuvent être très nombreux.  [...]

[Biologie Moléculaire] stratégie de clonage.

Je ne comprends pas trop comment choisir les amorces sens et anti sens,trouver la phase ouverte de lecture et les enzymes de restriction.  [...] il me semble que les enzymes de restriction reconnaissent les séquences palindromiques (ex. AAATTT).  [...]

amplification de l'ADN

moi, je veux savoir si, au moment de l'ajout de l'amorce, c'est possible de lier au bout de la sequence une suite de nucleotides qui auraient la meme fonction qu'une amorce...cela reviendrait a coller une suite de nucleotides a un brin d'ADN deja coupe. Etant donne que, in vivo, il existe des enzymes qui ont les proprietes de couper et coller des genes ou suites de nucleotides, je me demande si je peux les utiliser pour enchainer des bouts d'ADN.  [...] Et oui, il est également possible de faire des couper/coller de bouts d'ADN avec des enzymes de restriction. C'est comme ça qu'on fait des vecteurs pour transfecter des gènes dans des cellules. Mais c'est pas non plus de la PCR et on se sert pas d'amorces.  [...]

[Génétique] Plasmide

comment purifier le fragment linéaire apres amplification du plasmide pBR 322 dans escherichia coli et extraction de l'adn plasmidique.   [...] Lors de ta PCR t'as surement utilisé des amorces contenant des sites de restriction que tu dois utiliser donc voila tu commence par faire une digestion avec ces enzymes, tu dépose ensuite sur gel pour récuperer ton fragment, et ensuite tu purifie alors il existe plusieurs techniques de purfi pour des produits PCR recuperes à partir de gel.  [...]

digestion PCR

Après avoir digéré mon insert (un produit PCR avec 2 amorces) et mon vecteur (un plasmide extrait par miniprep) avec 2 enzymes de restriction, je voit sur gel 3 bandes au même niveau. J'ai utilisé un plasmide (extrait de la miniprep) non digéré comme contrôle qui était à un niveau un peu plus bas des autres. Est-ce que c'est normal.  [...] Ca serait bien plus pratique si tu pouvais nous mettre sur le forum une image de ton gel.   [...]

[Biologie Moléculaire] clonage en phase

Pour amplifier mon fragment OCI, je fais une PCR avec les amorces suivantes (aux quelles j'ai rajouté les sites d'enzymes de restriction car ils étaient absents de l'ORF).  [...] Je rejoins Piwi sur le fait que les enzymes de restriction sont des endonucléases. Allez faire un tour sur cette page pour voir quel est le nombre de nucléotides à ajouter avant vos sites de restriction pour que la réaction soit optimale.  [...]

[Génétique] Construire un vecteur de transgenèse dérivé des transposons

Pour ce faire nous allons réaliser une PCR du gène Tet avec deux amorces contenant des sites de reconnaissances pour les enzymes de restriction XbaI et HindIII. Visiblement les amplicons obtenus possèdent à chaques extrémités le site de reconnaissance pour ces enzymes de restrictions et une Adénosine (d'ailleurs là j'ai pas compris d'où elle vient).  [...] Dis, pourquoi on coupe avec ces enzymes de restriction précisément est-ce que tu as sous les yeux la carte génétique du plasmide avec son MCS.  [...]